鐵皮石斛同源四倍體工廠化快繁工藝研究

劉靜雯，梁暉輝，盧富華，李瑞蘭，黨儀泉，向增旭

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，南京 210095)

如今鐵皮石斛的人工種植方法有許多[14]，而植物組織培養(yǎng)中傳統(tǒng)的鐵皮石斛莖段繁殖速度慢，增殖系數(shù)低，不能滿足大量的工廠化育苗要求，因此育苗成為解決當(dāng)前鐵皮石斛工廠化生產(chǎn)的一個迫切問題。本研究在實驗室前期鐵皮石斛倍性研究的基礎(chǔ)上，對鐵皮石斛組培快繁技術(shù)的方法展開進一步的研究，探究鐵皮石斛同源四倍體的快繁途徑。通過誘導(dǎo)原球莖的發(fā)生、增殖、分化，建立一種與傳統(tǒng)莖段、分株繁殖不同的繁殖方法，探尋鐵皮石斛同源四倍體種質(zhì)保存、大規(guī)模擴繁和生產(chǎn)推廣應(yīng)用的新技術(shù)，從而找出一種更快速、高效的方法用于開發(fā)鐵皮石斛的優(yōu)良品種，為鐵皮石斛同源四倍體植株的種苗工廠化生產(chǎn)奠定新的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料是經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所向增旭教授鑒定的鐵皮石斛植株，鐵皮石斛同源四倍體為實驗室前期研究的同源四倍體株系。

1.2 試驗方法

1.2.1鐵皮石斛同源四倍體純合性鑒定隨機選取鐵皮石斛同源四倍體株系‘花自-2’的無菌試管苗，轉(zhuǎn)入無激素的MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)，20 d后再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。通過觀察試管苗葉片大小、葉色、株高、莖粗等表觀特征，初步判斷四倍體。氣孔鑒定：于超凈工作臺中選取‘花自-2’材料及對照株(CK)相同生長部位的葉片，用攝子撕取葉片下表皮臨時裝片，在顯微鏡下鏡檢拍照，隨機選取10個視野進行氣孔計數(shù)，觀察每個視野氣孔大小及氣孔密度。染色體鑒定：早上9：00～11：00取幼苗根尖(0.5～1 cm)，在冰水混合物中預(yù)處理24 h，于4 ℃冰箱中卡諾固定液(乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h，在60 ℃ 1 mol/L HCl中解離5 min，卡寶品紅染色10 min，然后制片、鏡檢。流式細胞儀分析：稱取0.5 g組培苗葉片，用濾紙吸干水分后置于干凈培養(yǎng)皿中，加入2 mL預(yù)冷的組織解離液[80 mmol/L KCl, 20 mmol/L NaCl, 15 mmol/L Tris-HCl, 20 mmol/L Na2EDTA, 0.1%(V/V) TritonX-100, 2.0%(V/V) PVP-K30, pH 7.5]，用刀片一次性快速切碎葉片，過濾后于4 ℃ 2 000 r/min離心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室溫下反應(yīng)1 h后即可上樣測定。

1.2.2原球莖的誘導(dǎo)及生根鑒定以同源四倍體幼嫩莖段為試驗材料，以MS為基本培養(yǎng)基，選用5種激素組合對鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行優(yōu)化，把切好的莖段接種在供試培養(yǎng)基上(表1)，用鑷子輕輕按壓使莖段與培養(yǎng)基充分接觸，以便更好地吸取養(yǎng)分。每瓶接種4個莖段，每個處理重復(fù)10次。接種后定期觀察莖段誘導(dǎo)原球莖過程，統(tǒng)計誘導(dǎo)出原球莖的莖段個數(shù)及誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖所需時間，探究不同濃度激素配比對原球莖誘導(dǎo)率的影響，篩選原球莖誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。

在超凈工作臺上，將增殖的原球莖分割成團塊轉(zhuǎn)入供試生根培養(yǎng)基中，選用生長素NAA、基本培養(yǎng)基和香蕉汁為3個試驗因素，激素NAA濃度設(shè)0、0.5 和1.0 mg/L 3個水平，基本培養(yǎng)基設(shè)置1/2 MS、MS和1/4 MS 3個水平，香蕉汁設(shè)計5%、10%、15% 3個水平。本試驗不考慮因素間的交互作用，各因素隨機排列，采用L9(33)正交表，進行3因素3水平(表2)正交試驗，共9個處理。每個培養(yǎng)基放入5團原球莖，每組試驗設(shè)10個重復(fù)，生根周期設(shè)定時長為6周，試驗結(jié)果以每株苗平均生根數(shù)量為評價指標(biāo)。將由四倍體莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的原球莖放入最佳生根培養(yǎng)基中生根，同時把新生的根進行預(yù)處理，進行根尖染色體鑒定工作。

1.2.3原球莖的增殖將由嫩莖誘導(dǎo)形成的原球莖接種在供試原球莖增殖培養(yǎng)基上。根據(jù)天然復(fù)合物馬鈴薯的添加可以促進增殖與發(fā)育[15]，因此選用MS+15%馬鈴薯提取液為基本培養(yǎng)基。選用NAA、6-BA、KT為3個試驗因素，KT設(shè)0、0.2和0.5 mg/L 3個水平，6-BA設(shè)0.2、0.5 和1.0 mg/L 3個水平，NAA設(shè)0.2、0.5 和1.0 mg/L 3個水平。本試驗采用3因素3水平正交試驗(表3)，共9個處理，每個處理重復(fù)5次，每瓶接入5團原球莖。在超凈工作臺上，選取長勢均勻一致的原球莖，按壓接種至供試培養(yǎng)基，每5 d觀察原球莖增殖狀況，生長狀況及分化程度。

表1 備選原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基

表2 生根培養(yǎng)基選擇正交試驗表

1.2.4原球莖的分化將由莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的增殖充分成熟的較大原球莖塊切割成直徑5～8 mm左右的小塊，放入培養(yǎng)基中，探究6-BA與NAA不同激素水平對原球莖分化影響的試驗(表4)，在無菌條件下進行分化培養(yǎng)，50 d后統(tǒng)計不同培養(yǎng)基的原球莖分化率，確定原球莖分化的最適激素組合濃度。

在激素確定的基礎(chǔ)上，往培養(yǎng)基中添加不同濃度的香蕉汁和馬鈴薯提取液探究外源有機物對原球莖分化的影響，從而選擇適宜原球莖分化的最佳有機物，以此確定原球莖最佳分化培養(yǎng)基。

前列腺位于盆腔深部，位置低、空間小，是機器人在泌尿外科的主要應(yīng)用方向之一。與傳統(tǒng)腹腔鏡手術(shù)相比，機器人前列腺癌根治術(shù)可明顯降低術(shù)中出血、縮短導(dǎo)尿管留置時間，同時減少圍手術(shù)期并發(fā)癥[6]。由于機器人手術(shù)開展時間短、經(jīng)驗積累尚不豐富，如何快速培養(yǎng)年輕醫(yī)師，使之迅速掌握機器人手術(shù)技巧，已成為目前亟待解決的問題。

表3 原球莖增殖配方正交試驗表

表4 不同激素水平對原球莖分化的影響

1.3 幼苗的轉(zhuǎn)接壯苗、練苗與移栽

將原球莖分化的幼苗選擇合適的培養(yǎng)基，進一步轉(zhuǎn)接壯苗，待幼苗長到適宜程度時，進行鐵皮石斛同源四倍體的煉苗，選擇不同煉苗時長，進行培養(yǎng)缽移栽試驗，記錄生長環(huán)境的溫度和澆水狀況，依據(jù)移栽后鐵皮石斛同源四倍體植株的的長勢，確定最佳的練苗時長、移栽時間和生長環(huán)境。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛‘花自-2’倍性鑒定結(jié)果

通過采用形態(tài)鑒別、氣孔解剖、根尖染色體計數(shù)及流式細胞儀分析相結(jié)合的方法，確定了‘花自-2’株系為純合的同源四倍體。在形態(tài)方面，四倍體株系與對照株系相比整體表現(xiàn)矮壯(圖1)；相同倍鏡下氣孔變大，密度與二倍體相比有所降低，在物鏡×40視野下氣孔的密度降低近1倍(圖2)；‘花自-2’染色體數(shù)為76條，而對照組株系根尖染色體數(shù)為38條，‘花自-2’染色體數(shù)目加倍(圖3)；經(jīng)流式細胞儀分析，對照株系DNA相對含量在100處出現(xiàn)峰值，‘花自-2’株系在200處出現(xiàn)峰值(圖4)，也標(biāo)明‘花自-2’為純合的同源四倍體。綜合以上4種方法，確定了實驗室前期誘導(dǎo)的鐵皮石斛‘花自-2’為純合的同源四倍體。

2.2 鐵皮石斛同源四倍體原球莖的誘導(dǎo)

由表5的試驗結(jié)果分析可知：以同源四倍體幼嫩莖段為試驗材料，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基時，添加不同濃度的6-BA、NAA、KT、IBA、2, 4-D等5種激素相互組合對莖段進行誘導(dǎo)處理，其誘導(dǎo)情況都明顯高于不添加任何激素的對照組。5種激素組合中以添加1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L KT + 0.0 mg/L IBA+0.0 mg/L 2, 4-D等5種激素濃度的組合培養(yǎng)基對鐵皮石斛同源四倍體原球莖的誘導(dǎo)最好，幼嫩莖段誘導(dǎo)原球莖的誘導(dǎo)成功率最佳，平均誘導(dǎo)率達到76.66%。

左.對照組(CK)；右.‘花自-2’圖1 鐵皮石斛生根苗形態(tài)Left. CK；Right. ‘Huazi-2’Fig.1 Rooting seedling form of D. of ficinale Kimura et Migo

‘花自-2’(上)與對照CK(下) 物鏡×10(左)、物鏡×40(右)圖2 鐵皮石斛葉片氣孔圖‘Huazi-2’ (upper) and CK (lower), objective lens×10 (left) and objective lens×40 (right)Fig.2 Leaf stomata of D. of ficinale Kimura et Migo

左.對照組(CK)；右.‘花自-2’圖3 鐵皮石斛根尖染色體圖Left. CK；Right. ‘Huazi-2’Fig.3 Root tip chromosome of D. of ficinale Kimura et Migo

左.對照組(CK)；右.‘花自-2’圖4 鐵皮石斛流式細胞儀分析圖Left. CK；Right. ‘Huazi-2’Fig.4 Flow cytometry analysis of D. of ficinale Kimura et Migo

編號No.激素濃度Hormone concentration /(mg/L)KTNAA6-BAIBA2, 4-D誘導(dǎo)率Inductivity/%10000012.4321.00.20.50044.5431.00.50.20043.3342.00.20.50047.8652.00.50.20059.9960.50.21.00066.4570.20.51.00076.6680.50.22.00043.3390.20.52.00055.6810001.00.21.035.4611001.00.51.032.3112002.00.22.044.5413002.00.52.042.3314001.00.50.233.4515001.00.20.535.6116002.00.50.234.3717002.00.20.537.88

2.3 原球莖的生根培養(yǎng)及染色體鑒定

將原球莖分開后放入不同的供試生根培養(yǎng)基中，不同生長素NAA濃度、基本培養(yǎng)基及香蕉汁對鐵皮石斛原球莖生根率均可產(chǎn)生影響。從表6中可以看出NAA濃度選擇0.5 mg/L時，鐵皮石斛原球莖的生根率高于其他2組；不添加NAA的培養(yǎng)基鐵皮石斛原球莖的生根速度慢，生根率較低且根尖不明顯；而以1/4 MS、MS為基本培養(yǎng)基生根狀態(tài)均不如以1/2 MS為基本培養(yǎng)基的生根狀態(tài)。香蕉汁的添加量暫時沒有太大的差別可循。因此最佳生根培養(yǎng)基組合是：NAA濃度選擇0.5 mg/L、1/2 MS培養(yǎng)基、15%香蕉汁，其生根率可達92.77%。

圓球莖轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基40～50 d后，取顏色亮白，形狀細長，且根尖狀態(tài)良好的根，進行根尖染色體再鑒定，經(jīng)鑒定原球莖所生根的根尖染色體數(shù)仍為76條，表明誘導(dǎo)的倍性可穩(wěn)定遺傳。

2.4 鐵皮石斛同源四倍體原球莖的增殖與分化

2.4.1原球莖增殖試驗表明：在MS +15%馬鈴薯提取液培養(yǎng)基中添加不同種類激素，原球莖增殖系數(shù)均出現(xiàn)不同程度變化。從表7可知：在適宜激素濃度比例下，原球莖增殖未出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象或玻璃化程度較輕，其中原球莖增殖較好的是6號培養(yǎng)基，增殖系數(shù)遠比期待數(shù)值要高。含有較高濃度激素的KT培養(yǎng)基，原球莖的長勢均不如低濃度的KT培養(yǎng)基與不加KT 的培養(yǎng)基。另外原球莖的增殖系數(shù)在NAA濃度較低的范圍內(nèi)培養(yǎng)效果較好，隨著濃度的增加，原球莖的增值系數(shù)受到限制。在較低濃度范圍內(nèi)原球莖增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的增加有所上升，1.0 mg/L 6-BA原球莖增殖程度高。綜上所述：最優(yōu)增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+15%馬鈴薯提取液。

2.4.2原球莖分化本試驗在1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA、6-BA探究對原球莖分化的影響。從表8的試驗結(jié)果中可知：以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的NAA、6-BA對原球莖的分化影響顯著。如表中所示，不添加激素的7號培養(yǎng)基，分化率明顯低于含有不同激素水平的培養(yǎng)基；僅添加6-BA的組別(編號1、2)原球莖分化程度明顯高于其他組，且0.5 mg/L水平下的6-BA對原球莖分化率高于0.2 mg/L水平；單獨添加NAA的組別(編號3、4)分化芽數(shù)低于兩種激素都添加的組別(編號5、6)和僅添加6-BA的組別(編號1、2)，且NAA濃度越高，分化率越低。因此，原球莖分化最佳的激素水平為0.5 mg/L 6-BA，其圓球莖分化率達到85.70%。

表6 生根培養(yǎng)基試驗結(jié)果表

表7 不同組別對原球莖增殖的影響

注： +、++、+++和++++ 為原球莖增殖程度升序排列：+表示少數(shù)原球莖，增殖差，++表示原球莖增殖一般，+++表示原球莖增殖較好，++++ 表示原球莖增殖極好

Note：The +, ++, +++ and ++++ for protocorm proliferation degree in ascending order: + minority protocorm proliferation, ++ normal protocorm multiplication, +++ better protocorm multiplication, ++++ excellent protocorm proliferation

在1/2MS培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L 6-BA的基礎(chǔ)上，加入有機復(fù)合物馬鈴薯提取液與香蕉提取液來探究對原球莖的分化的影響。通過觀察，添加20%馬鈴薯提取液的養(yǎng)基分化明顯，苗長勢好于添加20%香蕉提取液與對照(CK)的培養(yǎng)基。因此選擇20%馬鈴薯提取液作為原球莖分化培養(yǎng)試驗的有機物添加。由此可知：鐵皮石斛原球莖分化最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+20%馬鈴薯提取液。

2.5 幼苗的轉(zhuǎn)接壯苗、練苗與移栽

將幼苗轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)基進一步壯苗，待幼苗長到適宜程度時，進行鐵皮石斛同源四倍體組培苗的煉苗。試驗結(jié)果表明，不同的煉苗時長，對鐵皮石斛同源四倍體幼苗的成活率影響不同。根據(jù)試驗記錄可知，鐵皮石斛同源四倍體植株的最佳的練苗時長為5 d、其移栽成活率最高，成活植株可達92.30%。

2.6 鐵皮石斛同源四倍體工廠化組培工藝流程

試驗前期一直采用莖段快繁鐵皮石斛同源四倍體的途徑來對現(xiàn)有的同源四倍體株系進行擴繁。試驗表明：莖段繁殖的增殖系數(shù)低，雖然添加有機復(fù)合物的培養(yǎng)基可以使增值系數(shù)在一定程度上有所增加，但仍不能滿足工廠化生產(chǎn)需求。而通過原球莖誘導(dǎo)、增殖與分化的途徑來進行增值，其增值系數(shù)大大提高，從而可以逐步滿足工廠化生產(chǎn)的需求。原球莖的誘導(dǎo)、增殖與分化并進行完整工藝流程如圖5所示。

表8 不同激素水平對原球莖分化的影響

圖5 鐵皮石斛同源四倍體組培快繁工藝流程圖Fig.5 D. of ficinale Kimura et Migo homologous tetraploid’s engineering flow sheet

3 討 論

在多倍體誘導(dǎo)研究中，首先觀察外部形態(tài)特征可初步判斷四倍體株系，該方法最為簡便快捷；其次利用顯微鏡觀察氣孔等顯微結(jié)構(gòu)，可做進一步的判斷。顯微結(jié)構(gòu)是利用根尖細胞染色體數(shù)目來判斷植株倍性。本試驗的方法步驟和韓超等[16]的桉樹壓片過程有所不同，我們用冰水混合物代替了8-羥基喹啉處理，使試驗操作更具安全性。然而在染色體鑒定工作中，還存在許多人為控制的因素制約著壓片的成功率，因此，流式細胞儀的鑒定方法在倍性判斷方面，可以在提高鑒定效率的基礎(chǔ)上，保證倍性鑒定結(jié)果的可靠性，而且以上幾種方法結(jié)合，更加確定了倍性純合的可靠性，本試驗研究結(jié)果與王榮邦等[17]的菊花染色體倍性鑒定研究結(jié)果相一致。

本試驗以鐵皮石斛同源四倍體的幼嫩莖段為外植體成功誘導(dǎo)了原球莖的產(chǎn)生，選擇的莖段以1.5～2.5 cm并帶有1～2個莖節(jié)為宜，莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖的最佳培養(yǎng)基為MS +1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，誘導(dǎo)率為76.66%，且誘導(dǎo)出的原球莖緊密度適中，長勢好，色深綠;與朱慶豎等[18]鐵皮石斛的原球莖誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2, 4-D有相同也有不同。

進行鐵皮石斛同源四倍體的倍性再鑒定，證明了誘導(dǎo)的倍性可穩(wěn)定遺傳。研究發(fā)現(xiàn)在原球莖的誘導(dǎo)過程中由莖段萌生的原球莖在特定激素濃度下存在分化成苗的趨勢，而在原球莖增殖試驗中也存在部分原球莖分化的現(xiàn)象，由此而來，在整個試驗過程中，增殖的同時會伴有分化現(xiàn)象。在原球莖的增殖過程中，發(fā)現(xiàn)有出苗不整齊的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致原球莖發(fā)育成苗的不同步化。所以在試驗過程中，必須探究出一種最適宜的培養(yǎng)條件使原球莖以均勻的速度同步生長，來更好地滿足工廠化育苗的需求。這種條件不僅與內(nèi)源狀態(tài)有關(guān)，還可能與室溫、光照等息息相關(guān)。

本試驗探究了不同添加激素種類與濃度、有機物的種類與濃度對原球莖的增殖與分化的影響，以四倍體鐵皮石斛的幼嫩莖段作為外植體進行原球莖的誘導(dǎo)，可以通過原球莖的增殖與分化最終獲得大量的植株，加快了鐵皮石斛的繁殖效率。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+15%馬鈴薯提取液為原球莖最適宜的增殖培養(yǎng)基；最佳的原球莖分化的配方為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+20%馬鈴薯提取液，與朱慶豎等[18]研究的原球莖分化最適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT，陳瀟倩[15]的1/2 MS+0.2 mg/L 6-BA+20%馬鈴薯提取液, 有些不同。試驗中證明了添加馬鈴薯提取液、香蕉汁能有效地促進鐵皮石斛原球莖的分化，這與楊柳平等[19]研究得出的添加香蕉汁會抑制圓球莖的分化結(jié)果不同，而與方中明等[20]香蕉能促進原球莖的分化研究結(jié)果相同。

試驗也進行了莖段擴繁培養(yǎng)基的篩選，結(jié)果表明，莖段擴繁的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+15%香蕉汁，但莖段擴繁增殖系數(shù)低，不能滿足大規(guī)模種苗工廠化生產(chǎn)的需要；以幼嫩莖段為外植體誘導(dǎo)鐵皮石斛同源四倍體原球莖，通過原球莖增殖、分化及生根培養(yǎng)，建立了比莖段繁殖效率更高的鐵皮石斛同源四倍體高頻快繁技術(shù)體系，為鐵皮石斛同源四倍體種質(zhì)的生產(chǎn)推廣提供了技術(shù)支撐。