菘藍(lán)IiCYP79F1基因的克隆與表達(dá)分析

屈新運(yùn)，秦苗苗，趙桂紅,2，張?zhí)煲恚蜿?yáng)，李 燾*

(1 西北瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)，西安 710119； 2 長(zhǎng)安區(qū)第八中學(xué)，西安 710106)

芥子油苷(glucosinolates，GS)主要存在于十字花科植物，是一種具有抗蟲、抗病活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。在植物體內(nèi)天然存在的芥子油苷達(dá)200多種[2-3]，其生物合成前體主要是氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈的不同分為脂肪族芥子油苷、吲哚族芥子油苷和芳香族芥子油苷[4]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中芥子油苷的生物合成途徑主要包括前體氨基酸側(cè)鏈延伸、核心結(jié)構(gòu)形成和次級(jí)修飾3個(gè)步驟。在側(cè)鏈延伸過(guò)程中，前體氨基酸在CYP79F家族的側(cè)鏈專一性細(xì)胞色素P450單加氧酶的催化作用下產(chǎn)生相應(yīng)的醛肟；之后在CYP83家族的細(xì)胞色素P450催化下，醛肟被氧化成不穩(wěn)定的酸式硝基化合物或氧化腈[5]。在擬南芥脂肪族芥子油苷的合成過(guò)程中，CYP79F1和CYP79F2能夠催化甲硫氨酸等脂肪族前體氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛肟[6]，其中CYP79F1調(diào)控長(zhǎng)鏈或短鏈脂肪族芥子油苷的合成，而CYP79F2主要調(diào)控短鏈脂肪族芥子油苷的合成[7]；過(guò)表達(dá)CYP79F1和CYP79F2能夠使得短鏈脂肪族芥子油苷的含量增加7倍，同時(shí)吲哚族芥子油苷的含量也有一定程度的上升[8]。此外，CYP79F1在西蘭花(BrassicaoleraceaL.var.italica)中的過(guò)表達(dá)研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中短鏈脂肪族芥子油苷4MSOP和4MSOB均有顯著增加[9]。在中國(guó)白菜(Brassicapekinensis)中過(guò)表達(dá)脂肪族芥子油苷合成的關(guān)鍵酶基因MAM1、CYP79F1和CYP83A1，可以顯著提高脂肪族乃至總芥子油苷的含量[10]。由此可見，CYP79F1基因在不同的十字花科植物芥子油苷的生物合成過(guò)程中均發(fā)揮了十分重要的作用。

菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)是十字花科(Cruciferae)菘藍(lán)屬(Isatis)二年生草本植物，其干燥的根和葉即“板藍(lán)根”和“大青葉”，二者均為歷版藥典所收錄，具有清熱解毒、抗菌消炎[11-12]、增強(qiáng)免疫力[13]、防癌抗癌[14-15]等功效。目前從菘藍(lán)中分離得到的化學(xué)成分主要包括生物堿類、含硫化合物、有機(jī)酸類及芥子苷類化合物等[16]，芥子油苷類化合物則因其具有抗癌功效而被廣泛關(guān)注，關(guān)于這一物質(zhì)在菘藍(lán)中的生物合成過(guò)程和分子調(diào)控機(jī)理鮮有報(bào)道。迄今為止，菘藍(lán)中部分參與芥子油苷生物合成過(guò)程的關(guān)鍵酶基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子已被相繼克隆，包括CYP450基因家族的IiCYP83A1[17]和IiCYP83B1[18]，以及轉(zhuǎn)錄因子IiMYB34[19]等。此外，CYP79F1也先后在小白菜(BrassicacampestrisL. ssp.chinensisvar.communis)[20]、西蘭花[9]和芥藍(lán)(BrassicaalboglabraL. H. Bailey)[21]中被克隆，但其生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。

本研究首次從菘藍(lán)中克隆得到與脂肪族芥子油苷合成相關(guān)的CYP79家族的IiCYP79F1基因，為后期該基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為后期培育芥子油苷含量升高的菘藍(lán)新品種提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材 料

菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)種子為本實(shí)驗(yàn)室留存，播種于實(shí)驗(yàn)室溫室大棚中，培養(yǎng)條件為：溫度(25±2)℃；晝/夜光周期16 h /8 h；濕度60%～80%。

1.2 方 法

1.2.1菘藍(lán)總RNA提取和cDNA合成取菘藍(lán)新鮮葉片，置液氮中速凍，并于-80 ℃保存。按照植物總RNA提取試劑盒(購(gòu)自西安淳風(fēng)生物科技有限公司)流程提取菘藍(lán)葉片總RNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度；再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自寶生物工程有限公司)，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃保存。

1.2.2菘藍(lán)基因組DNA提取取菘藍(lán)植株的新鮮葉片，按照植物基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)流程提取菘藍(lán)葉片gDNA，-20 ℃保存。

1.2.3基因克隆與鑒定依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的菘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，搜索CYP79F1基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上游引物F(5′-ATGACAATGATGATGATGAGC-3′)和下游引物R(5′-TCAAGAGCGGAATTTTGGAT-3′)，送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司合成。分別以菘藍(lán)cDNA和gDNA為模板，參考PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min；共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將所得 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)進(jìn)行目的片段純化，最后采用AidLab零背景pTOPO-Blunt Simple平末端克隆試劑盒(購(gòu)自艾德萊生物科技有限公司)將載體與目的片段連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并送測(cè)序鑒定。

1.2.4生物信息學(xué)分析利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找目的基因的開放閱讀框，Perot-Param(http://web.expasy.org/protparam/)分析相應(yīng)蛋白的理化性質(zhì)，TMHMM 2.0 Server(http://web.expasy.org/protparam/)分析該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，Psort Prediction(http://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位，SignalP-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)該蛋白是否具有信號(hào)肽，ExPASy NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析該蛋白的磷酸化位點(diǎn)，ScanProsite tool(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)分析該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，SOPMA(https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma)和Swiss Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)分別分析該蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。從NCBI搜索親緣關(guān)系較近物種的CYP79F1序列，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5基因表達(dá)模式分析分別以菘藍(lán)根、莖、葉、花、果，萌芽期(10 d)、幼苗期(30 d)、生長(zhǎng)期(90 d)和花期的葉片，500 μmol/L MeJA、10 mmol/L Ag+、4 ℃低溫、9.0%葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、300 μmol/L SA，及機(jī)械損傷處理后的葉片cDNA為模板，根據(jù)目的基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)熒光定量上游引物F(5′-GGAGTTAGACGAAGTGGTGGGA-3′)和下游引物R(5′-CCGAGGGTGGTATCTTGACG-3′)。以管家基因IiActin(AY870652.1)作為內(nèi)參基因，其引物序列為F(5′-AGGAATCGCTGACCGTATG-3′)和R(5′-TGGACCCGACTCATCGT-ATT-3′)。采用qRT-PCR技術(shù)，分別檢測(cè)目的基因在菘藍(lán)不同組織部位、不同發(fā)育時(shí)期，以及不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菘藍(lán)CYP79F1基因的克隆

分別以菘藍(lán)的cDNA和gDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為1 600和2 200 bp擴(kuò)增片段(圖1)，產(chǎn)物經(jīng)回收純化、測(cè)序分析后顯示，該基因的基因組全長(zhǎng)為2 109 bp，含有3個(gè)外顯子及2個(gè)內(nèi)含子；ORF區(qū)為1 626 bp，編碼541個(gè)氨基酸(圖2)。Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與西蘭花CYP79F1核酸序列的相似性達(dá)93%，將其命名為IiCYP79F1，GenBank登錄號(hào)為KY774689.1。

2.2 IiCYP79F1編碼蛋白的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析

利用Perot-Param軟件對(duì)IiCYP79F1編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，IiCYP79F1蛋白分子量為61.58 kD，分子結(jié)構(gòu)式為C2759H4358N756O783S29，等電點(diǎn)為8.61，屬于堿性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)為39.43，說(shuō)明該蛋白較為穩(wěn)定，N-端為甲硫氨酸(Met)；總平均親水性GRAVY值為-0.296，為親水性蛋白。進(jìn)一步對(duì)IiCYP79F1跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位及磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析顯示，該蛋白含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸第15～37位(由外向內(nèi))和476～498位(由內(nèi)向外)，無(wú)信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(可信度：0.685)和質(zhì)膜(可信度：0.640)上；含有25個(gè)Ser位點(diǎn)、13個(gè)Thr位點(diǎn)和5個(gè)Tyr位點(diǎn)，共有43個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)IiCYP79F1可能受蛋白磷酸激酶的調(diào)控。

利用ScanProsite在線軟件對(duì)IiCYP79F1保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有保守的血紅素結(jié)合域FGtGRRGCVG，位于470～479之間(圖3)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白主要由α-螺旋(alpha helix，43.81%)、無(wú)規(guī)則卷曲(random coil，35.49%)、延伸鏈(extended strand，13.68%)和β-轉(zhuǎn)角(β-turn，7.02%)組成。利用Swiss Model構(gòu)建該蛋白的三維結(jié)構(gòu)(圖4)發(fā)現(xiàn)，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較高，其次為延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

M. DL2000; 1. cDNA; 2. gDNA圖1 IiCYP79F1基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of IiCYP79F1

圖2 IiCYP79F1的核酸及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of IiCYP79F1

2.3 IiCYP79F1編碼蛋白的同源性分析

利用NCBI的Blast程序分析菘藍(lán)IiCYP79F1與近緣種蛋白的氨基酸同源性。結(jié)果表明，IiCYP79F1編碼蛋白的氨基酸序列與西蘭花(Brassicaoleracea, ACB59213.1)的相似性為94%；與歐洲油菜(Brassicanapus, AGO59948.1)、蕪菁(Brassicarapa, ACR10252.1)和芝麻菜(Erucasativa, AGS49166.1)的相似性均為93%。由多序列比對(duì)結(jié)果(圖6)可知，菘藍(lán)IiCYP79F1與十字花科其他物種CYP79F1的結(jié)構(gòu)相似，均具有保守的血紅素結(jié)合域(Heme-binding motif，F(xiàn)GTGRRGCVG)、PERF序列(PERH)和K螺旋(K-helix，ETFR)。利用MEGA 5.0對(duì)菘藍(lán)IiCYP79F1和近緣種的CYP79F1進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)IiCYP79F1與芝麻菜(Erucasativa, AGS49166.1)的親緣關(guān)系最近(圖5)。

圖4 IiCYP79F1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted 3D structure model of IiCYP79F1

圖5 IiCYP79F1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis of IiCYP79F1

圖3 IiCYP79F1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain analysis of IiCYP79F1

黑色方框表示CYP450的保守結(jié)構(gòu)域圖6 IiCYP79F1與其他物種CYP79F1氨基酸序列比對(duì)Black box represents the CYP450’s conserved motifsFig.6 Amino acid sequence alignment of CYP79F1 and other species

2.4 IiCYP79F1基因的表達(dá)模式分析

采用qRT-PCR法對(duì)IiCYP79F1在根、莖、葉、花和果等不同組織部位，以及萌芽期、幼苗期、生長(zhǎng)期和花期等不同發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明：IiCYP79F1在菘藍(lán)莖中的表達(dá)水平最高，葉和花次之，其表達(dá)量由高到低依次為莖>葉>花>果>根(圖7，A)。此外，IiCYP79F1在菘藍(lán)不同發(fā)育階段均有表達(dá)，幼苗期、生長(zhǎng)期和花期的相對(duì)表達(dá)量顯著高于萌芽期，且以幼苗期表達(dá)量最高，達(dá)到萌芽期表達(dá)量的7.28倍(圖7，B)。由此可見，IiCYP79F1在菘藍(lán)不同組織部位和不同發(fā)育時(shí)期均有一定的差異表達(dá)，具有明顯的時(shí)空特異性。

不同小寫字母代表相對(duì)表達(dá)量在0.05水平上差異顯著。圖7 IiCYP79F1基因在菘藍(lán)不同組織、不同發(fā)育時(shí)期和不同誘導(dǎo)處理下的表達(dá)分析Different normal letters indicated significant difference for the relative expression at 0.05 levelFig.7 Expression patterns of IiCYP79F1 of I. indigotica Fort. for different tissues, stages and elicitors

此外，本研究還對(duì)IiCYP79F1在不同誘導(dǎo)子處理后的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。由圖7,C可知，IiCYP79F1在MeJA處理3 h后表達(dá)量顯著升高，并在6 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的11.09倍，此后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平下降，并于72 h降至對(duì)照水平；Ag+也能夠有效促進(jìn)IiCYP79F1的表達(dá)，處理12 h后該基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，為對(duì)照的14.05倍，總體呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)；葡萄糖對(duì)IiCYP79F1基因的表達(dá)呈明顯的促進(jìn)作用，IiCYP79F1基因在葡萄糖處理3 h后達(dá)到峰值，為對(duì)照的11.33倍；機(jī)械損傷也可以明顯促進(jìn)IiCYP79F1的表達(dá)，其表達(dá)水平在機(jī)械損傷48 h后出現(xiàn)峰值，為對(duì)照的7.93倍。相反地，低溫處理對(duì)IiCYP79F1基因的表達(dá)呈現(xiàn)一定的抑制效應(yīng)，處理1 h后該基因的表達(dá)降至對(duì)照的3.12%，48 h后僅為對(duì)照的1.66%；同時(shí)，其表達(dá)也受到SA的抑制作用，處理1 h后其表達(dá)即開始下降，并在6 h后下降至對(duì)照的14.78%。因此，IiCYP79F1基因顯著響應(yīng)MeJA、Ag+、低溫(4 ℃)、葡萄糖、SA和機(jī)械損傷等信號(hào)的誘導(dǎo)，低溫(4 ℃)和SA對(duì)該基因的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)，而各類誘導(dǎo)子對(duì)該基因的具體誘導(dǎo)機(jī)制有待于進(jìn)一步的深入研究。

3 討 論

芥子油苷及其水解產(chǎn)物在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程發(fā)揮多種生物學(xué)功能，既能有效地幫助植物抵御昆蟲和病原菌的侵襲，又能參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素的代謝，并具有明顯的抗癌活性[22-23]。因此，篩選和改良富含芥子油苷的植物品種已成為十字花科植物研究的熱點(diǎn)。本研究以菘藍(lán)為試驗(yàn)材料，成功克隆了參與芥子油苷生物合成的關(guān)鍵酶基因IiCYP79F1，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，探討了其在不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，以及各種誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況，相關(guān)研究結(jié)果均為首次報(bào)道。

芥子油苷的生物合成途徑主要有細(xì)胞色素P450的CYP79和CYP83兩個(gè)家族參與[24]。CYP79家族催化氨基酸形成相應(yīng)的乙醛肟，CYP83家族進(jìn)一步催化乙醛肟生成不穩(wěn)定的酸式硝基化合物[25]。CYP79F1編碼的蛋白主要負(fù)責(zé)催化甲硫氨酸向芥子油苷前體乙醛肟的轉(zhuǎn)化，且對(duì)短鏈脂肪族芥子油苷的合成起重要作用[26]。本研究結(jié)果表明，菘藍(lán)IiCYP79F1基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450基因家族成員，編碼541個(gè)氨基酸，與西蘭花CYP79F1的序列具有較高的相似性；該蛋白屬于堿性親水蛋白，含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，無(wú)信號(hào)肽；主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜上，含有25個(gè)Ser位點(diǎn)、13個(gè)Thr位點(diǎn)和5個(gè)Tyr位點(diǎn)，共計(jì)43個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；此外，該蛋白具有保守的血紅素結(jié)合域：FGtGRRGCVG，位于470～479位點(diǎn)之間；其氨基酸序列與西蘭花CYP79F1的氨基酸序列相似性最高，并與芝麻菜的親緣關(guān)系最近。

芥子油苷的合成受到許多非遺傳因素的影響。如茉莉酸甲酯能夠促進(jìn)油菜(BrassicanapusL.)和芥菜(BrassicajunceaL.)中I3M的積累[27]；經(jīng)水楊酸處理的油菜葉片中芥子油苷總量顯著提高[28]。在甘藍(lán)型油菜中，子葉、葉和莖中CYP79F1的轉(zhuǎn)錄水平高于花和角果，而在葉的發(fā)育過(guò)程中，其轉(zhuǎn)錄水平在年幼階段表達(dá)量較低[29]；芥藍(lán)中CYP79F1在莖、葉片和子葉中的表達(dá)量高于花和種子中的表達(dá)量[15]。本研究對(duì)菘藍(lán)IiCYP79F1在不同組織部位的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其在莖中的表達(dá)量最高，其次為葉、花、果和根；此外，該基因在幼苗期的表達(dá)量最高，顯著高于其他生長(zhǎng)發(fā)育階段，為萌芽期的7.28倍。因此，IiCYP79F1的表達(dá)具有明顯的組織特異性，但與已報(bào)道的十字花科其他植物中CYP79F1基因的表達(dá)模式存在不同。茉莉酸可以顯著增強(qiáng)擬南芥中芥子油苷生物合成相關(guān)的CYP79家族基因的表達(dá)[30]；羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor)中，CYP79F1基因的表達(dá)被MeJA誘導(dǎo)上調(diào)[31]；芥藍(lán)中脂肪族芥子油苷合成相關(guān)基因CYP79F1在葡萄糖處理后6 h表達(dá)上調(diào)，并在18 h達(dá)到最大值[32]；而低溫脅迫能顯著降低羽衣甘藍(lán)中總芥子油苷的含量[33]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),MeJA、Ag+、葡萄糖、機(jī)械損傷上調(diào)了IiCYP79F1的表達(dá)，而SA、低溫則抑制其表達(dá)，該基因的表達(dá)模式與十字花科其他植物存在一定的相似之處，但也有其特異性，具體的響應(yīng)機(jī)制仍需要深入探討。

本研究對(duì)菘藍(lán)IiCYP79F1進(jìn)行了克隆，通過(guò)生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式的研究，為該基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開展菘藍(lán)芥子油苷生物合成與調(diào)控機(jī)理的研究提供了依據(jù)。隨著更多的CYP79家族成員基因的克隆和功能驗(yàn)證，將有助于切實(shí)闡明菘藍(lán)芥子油苷的合成機(jī)理，為生物合成芥子油苷提供有效途徑，也為通過(guò)基因工程手段提高菘藍(lán)和十字花科其他植物的芥子油苷含量提供新的思路和途徑。