利用過(guò)氧化氫酶活性鑒別藥用原料乳豬肝和成年豬肝研究

羅清榮，李雪雁，鄭澤鑫，楊 林，李 玲，謝 果

（電子科技大學(xué)中山學(xué)院，廣東 中山 528402）

1 豬肝營(yíng)養(yǎng)概述

豬肝含有豐富的鐵、磷，還富含蛋白質(zhì)、卵磷脂和微量元素，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。自20世紀(jì)80年代，從乳鼠和部分切除的肝組織提取出生物活性物質(zhì)以來(lái)，對(duì)于肝臟提取物中活性成分的研究一直受到廣泛關(guān)注。

目前，從豬肝臟中可以提取制備肝素、豬肝酯酶、卵磷脂、肝水解肽等生化藥劑，具有重要的藥用價(jià)值。其中促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是從新鮮乳豬肝或未哺乳新生牛新鮮肝臟中提取的一種能夠促進(jìn)肝細(xì)胞再生的生物活性物質(zhì)，主要用于治療各種重型病毒性肝炎、慢性肝炎等疾病。實(shí)驗(yàn)表明，參考促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的生產(chǎn)工藝，以乳豬肝為原料制備肝水解肽，與成年豬、牛肝臟為對(duì)照，考察產(chǎn)品活性及收率差異，結(jié)果證明乳豬肝源制品的生物活性遠(yuǎn)高于成年豬、牛肝源制品，且含量及收率亦有所提高。

從臨床用藥的有效性考慮，以兩個(gè)月以內(nèi)的乳豬肝代替成年動(dòng)物肝臟制備的肝水解肽具有較高的應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)當(dāng)成為制藥企業(yè)的原料標(biāo)準(zhǔn)。但是，基于成本考慮，成年豬肝比乳豬肝價(jià)格低，而僅憑外觀又無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分乳豬豬肝和成年豬豬肝，因此，可能出現(xiàn)企業(yè)收購(gòu)的乳豬肝臟被成年豬肝臟所替代的風(fēng)險(xiǎn)。目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)成年豬肝和乳豬肝的標(biāo)準(zhǔn)和方法，造成企業(yè)收購(gòu)豬肝質(zhì)量檢測(cè)空白和質(zhì)量檢測(cè)監(jiān)督部門(mén)的監(jiān)管空白。為了解決這一問(wèn)題，急需研究出一個(gè)適于常規(guī)檢測(cè)的方法，以區(qū)別來(lái)源于成年豬和乳豬的豬肝。

過(guò)氧化氫酶廣泛存在于動(dòng)植物的各個(gè)組織、大部分需氧微生物體內(nèi)，是動(dòng)植物體內(nèi)清除自由基的基本酶類[1]。過(guò)氧化氫酶的作用是催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的分解，防止脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的氧化損傷[2]。動(dòng)物體內(nèi)一般不同組織的過(guò)氧化氫酶活性不同，基本由大到小的排序是：肝、腎、肺、心、脾、胃、腦[3]。不同生長(zhǎng)階段中，由于代謝能力的差異，動(dòng)物肝臟中的過(guò)氧化氫酶的酶活性也存在差異。本文利用碘量法測(cè)定過(guò)氧化氫酶的酶活性大小，通過(guò)研究對(duì)比成年豬和乳豬的豬肝中過(guò)氧化氫酶的活性差異，建立簡(jiǎn)單有效的生化檢測(cè)方法，鑒定成年豬肝和乳豬肝，實(shí)現(xiàn)藥企和監(jiān)管部門(mén)常規(guī)檢測(cè)和監(jiān)管，從而保障乳豬肝源藥品的質(zhì)量。

2 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 豬肝

成年豬肝在菜市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。乳豬肝由廣東中山市隆賦藥業(yè)提供。

2.2 試劑

pH分別為6、7、8、9的1%甘露醇緩沖溶液（內(nèi)含0.1 mol/L的磷酸鹽），保存于4 ℃的冰箱中；40 g/L鉬酸銨溶液，0.15 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.155 mol/L KCI溶液，0.9%NaCI溶液，0.1 mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 粗酶液的提取

本實(shí)驗(yàn)采用緩沖液提取法來(lái)提取豬肝中的過(guò)氧化氫酶，先用紙巾擦凈豬肝表面的血水，將豬肝剝?nèi)ツひ?，切去結(jié)締組織后稱重，取成年豬肝10 g，按所需的料液比1∶8（豬肝：1%甘露醇磷酸緩沖溶液）及pH[4]加入相應(yīng)的1%甘露醇磷酸緩沖溶液（內(nèi)含0.1 mol/L的磷酸鹽），記號(hào)。分別于勻質(zhì)機(jī)中在2 000 r/min下攪碎30 s左右，制得的勻漿液分別在10 000 r/min下離心10 min，取上清液1 mL，最后用1%甘露醇磷酸緩沖溶液稀釋10倍，制得粗酶液。

3.2 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法

測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性是利用過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫的特性，用一定量的粗酶液在25 ℃的條件下與足量的過(guò)氧化氫反應(yīng)規(guī)定時(shí)間后，終止其反應(yīng)。通過(guò)測(cè)定剩余過(guò)氧化氫的量，來(lái)計(jì)算豬肝中過(guò)氧化氫酶的活性。

計(jì)算公式：

將冷藏4 ℃冰箱內(nèi)的成年豬肝和乳豬肝，取出置于冰水浴中解凍。按粗酶液提取方法，稱取已冷藏的豬肝10 g，分別加入料液比為1∶8，pH為7.0、8.0、9.0的1%甘露醇磷酸緩沖溶液，制備豬肝粗酶液，做好標(biāo)記，置于冰水浴中待用。用Na2S2O3測(cè)定其酶活性，平行測(cè)定3次，并做空白對(duì)照組。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析如表1～3所示。

表1 成年豬肝與乳豬肝中過(guò)氧化氫酶的活性對(duì)比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（耗用Na2S2O3體積，單位：mL）

表2 成年豬肝與乳豬肝中過(guò)氧化氫酶的活性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果［單位mg·g-1·min-1］

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果：行對(duì)比F＞Fcrit，且Pvalue＜0.01，這說(shuō)明乳豬肝和成年豬肝過(guò)氧化氫酶活性兩組數(shù)據(jù)差異極其顯著。

5 結(jié)語(yǔ)

肝臟中含有的活性物質(zhì)有過(guò)氧化氫酶、線粒體F1-ATP合酶、谷氨酸脫氫酶、輔酶A等。其中過(guò)氧化氫酶在機(jī)體中廣泛存在，其中主要存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體內(nèi)，約占過(guò)氧化物酶體酶總量的40%，被認(rèn)定為是過(guò)氧化物酶體的標(biāo)志酶?？椎聞俚萚3]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶的分布特點(diǎn)除具有一定的組織差異外，其量的多少還和動(dòng)物的發(fā)育時(shí)期有關(guān)，同時(shí)受環(huán)境因子的影響。已報(bào)道小鼠各組織CAT的活性隨著年齡的變化表現(xiàn)出較大差異。小鼠肝、腎組織中過(guò)氧化氫酶的活性在1～4月齡間與年齡相關(guān)性不顯著，在4～18月齡間隨年齡增加而降低。小鼠肝、腎、肺、心、脾、胃、腦等組織中過(guò)氧化氫酶的活性隨年齡變化而變化，機(jī)體過(guò)氧化氫酶活性的降低與機(jī)體衰老密切相關(guān)[4]。關(guān)于過(guò)氧化氫酶活性在豬的組織（包括肝臟）中隨年齡分布的情況未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)顯示，乳豬肝中過(guò)氧化氫酶活性比成年豬肝的過(guò)氧化氫酶活性低，而且兩者差異極其顯著。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，乳豬和成年豬的豬肝中過(guò)氧化氫酶活性存在明顯差異，可作為鑒別兩者的一個(gè)生化指標(biāo)。

表3 pH7.0成年豬肝與乳豬肝中過(guò)氧化氫酶的活性差異顯著性分析