基于SWATH技術(shù)篩選影響烏珠穆沁羊肉品質(zhì)的蛋白

謝遇春，米 璐△，車天宇，奈日樂(lè)，馬麗娜，楊 峰，王志新，蘇 蕊，張燕軍，王瑞軍,，趙艷紅，王志英，何利兵, 劉志紅*，李金泉*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部肉羊遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古金萊牧業(yè)科技有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100)

烏珠穆沁羊?yàn)閮?nèi)蒙古特有品種，其肉質(zhì)鮮嫩，而且耐粗飼，適合在天然草場(chǎng)放牧，素有“天下第一羊”的美譽(yù)。沙里[1]研究顯示烏珠穆沁羊中氨基酸含量豐富，尤其是8月齡烏珠穆沁羊氨基酸含量最高，且人體必需氨基酸異亮氨酸在8月份烏珠穆沁羊中積累最為豐富。眾所周知,肌肉除了水分之外主要由蛋白質(zhì)組成，氨基酸組成不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)差異，而蛋白質(zhì)的形成是一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄翻譯的過(guò)程，故對(duì)不同部位肌肉進(jìn)行蛋白質(zhì)組成及差異探究對(duì)進(jìn)一步探索肉質(zhì)差異有著重要意義。

肉的顏色、系水力、pH、嫩度、風(fēng)味及肌內(nèi)脂肪含量是衡量肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，而肌纖維類型對(duì)肌肉的pH，失水率，肉色等有著顯著的影響[2-5]。肌纖維類型可在代謝特征、收縮功能、肌球蛋白重鏈(MyHC)的多態(tài)性三個(gè)方面進(jìn)行分類，根據(jù)其代謝特征可將肌纖維分為有氧代謝型和酵解代謝型。根據(jù)肌肉的收縮功能肌纖維可以分為Ⅰ型和Ⅱ型，依據(jù)肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)的多態(tài)性，可分為Ⅰ型、Ⅱa 型(快速氧化型)、Ⅱb 型(快速酵解型)和Ⅱx 型(中間型)[6-9]。而本研究意在利用各種影響肌肉品質(zhì)的因素篩選影響肌肉品質(zhì)的差異蛋白，為進(jìn)一步探索其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。目前，有關(guān)烏珠穆沁羊不同部位肉質(zhì)的研究較少，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[10-14]對(duì)烏珠穆沁羊的研究更是鳳毛麟角。為了揭示烏珠穆沁羊肌肉蛋白表達(dá)的差別及對(duì)應(yīng)差異蛋白對(duì)該部位肉品質(zhì)的影響，本研究采用SWATH方法，對(duì)烏珠穆沁羊背最長(zhǎng)肌、臀部肌肉進(jìn)行蛋白質(zhì)定性和定量分析，找到了臀部肌肉和背最長(zhǎng)肌總蛋白以及對(duì)肉質(zhì)品質(zhì)有顯著影響差異蛋白，同時(shí)也為肉品質(zhì)的快速鑒定與溯源提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣本采自內(nèi)蒙古烏珠穆沁旗，采集3只8月齡烏珠穆沁羊背最長(zhǎng)肌與臀部肌肉兩個(gè)部位樣本。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總蛋白提取 取適量樣品置于液氮中研磨，加入1%SDS裂解液，室溫放置20 min，每隔1 min在渦旋儀上渦旋30 S，超聲破碎2 min，4 ℃，12 000 r/min 離心30 min，取上清。使用BCA(Bioteke)試劑盒進(jìn)行總蛋白濃度測(cè)定。

1.2.2 總蛋白酶解 100 μg總蛋白加入200 μL 8 M尿素與10 mM DTT，37攝氏度變性1 h，12 000 rpm離心40 min，加入200 μL尿素、震蕩、12 000 rpm離心30 min重復(fù)兩次，加入200 μL 50 mM IAA避光反應(yīng)30 min，12 000 rpm離心30 min。加入100 μL碳酸氫銨，12 000 rpm離心20 min，重復(fù)3次。加入適量trypsin 37 ℃孵育過(guò)夜。12 000 rpm離心30 min。加入50 μL碳酸氫銨，12 000 rpm離心30 min，重復(fù)2次。收集濾液，凍干，準(zhǔn)備上機(jī)。

1.3.3 液相色譜質(zhì)譜連用采集數(shù)據(jù) 取適量肽段凍干粉，A相復(fù)溶，上機(jī)獲取IDA與SWATH數(shù)據(jù)。離子源: IDA掃描模式:正離子;噴霧電壓: 2.3 kV;離子源溫度: 150 ℃。蛋白鑒定模式: 一級(jí)掃描模式: 全掃描; 一級(jí)掃描范圍: m/z 150～1 200; TO分辨率設(shè)為30 000; 選擇窗口: 0.4 Da；碎裂模式：CID; 碎裂能量: 動(dòng)態(tài)碎裂; 二級(jí)掃描范圍: m/z 100～1 500; 循環(huán)模式: 動(dòng)態(tài)排除掃描; 動(dòng)態(tài)排除時(shí)間: 18 s; SWATH定量模式: 一級(jí)掃描模式: 全掃描; 一級(jí)掃描范圍: m/z 150～1200; TOF分辨率設(shè)為30 000; 間隔窗口25 amu; 碎裂模式: CID; 碎裂能量: 動(dòng)態(tài)碎裂; 二級(jí)掃描范圍: m/z 100～1 500;循環(huán)模式: 依次均勻掃描。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

1.3.4.1 蛋白鑒定 將液相色譜質(zhì)譜連用采集的背最長(zhǎng)肌肉與臀部肌肉IDA數(shù)據(jù)利用Protien Pilot4.5軟件進(jìn)行搜庫(kù)，蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于UNIPROT/SWISS-PROT。

1.3.4.2 保留時(shí)間校準(zhǔn) 利用Peak View軟件，對(duì)背最長(zhǎng)肌肉與臀部肌肉的SWATH數(shù)據(jù)與IDA數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)，做定量分析。

1.3.4.3 差異蛋白的篩選 應(yīng)用Marker View軟件的T檢驗(yàn)繪制火山圖，篩選2組數(shù)據(jù)的PValue值與Fold Change的log值等兩個(gè)因素繪制，橫坐標(biāo)代表差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表PValue值，且Fold Change以2為底的對(duì)數(shù)變換。以PValue值<0.05、差異倍數(shù)> 2或 < 0.5作為閾值選取背最長(zhǎng)肌肉與臀部肌肉的差異蛋白。

1.3.4.4 在uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)中對(duì)差異蛋白查詢并注釋其功能。

2 結(jié)果與分析

2.4 總蛋白提取結(jié)果

取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，電泳檢驗(yàn)蛋白質(zhì)提取效果如圖1所示。由圖1可以看出，蛋白質(zhì)提取效果較好，上樣量一致，蛋白條帶均一，條帶清晰，說(shuō)明蛋白濃度測(cè)定精準(zhǔn)，可用于后期試驗(yàn)。

圖1 SDS-PAGE電泳圖M.Marker蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品；A.背最長(zhǎng)肌肉；B.臀部肌肉；1-3代表生物重復(fù)Fig.1 Electrophoresis diagramM.Standard of Marker protein molecular A.Represents the longest muscle in the back;B.Represents the buttock;1-3. Represents the biological repetition

2.2 烏珠穆沁羊肉總蛋白鑒定

本研究以UniProt/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)為背景，對(duì)背最長(zhǎng)肌和臀肌肌肉蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，建立了背最長(zhǎng)肌肉和臀肌肌肉的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。結(jié)果顯示，在1%假陽(yáng)性條件下，共搜索到1003種蛋白質(zhì)與18667種肽段，如圖2所示。

2.3 蛋白主成分分析

主成分分析是利用教學(xué)方法，將可能存在相關(guān)的一組蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為一組不相關(guān)的新變量的分析方法[15]。在本次試驗(yàn)中，樣本點(diǎn)之間距離越遠(yuǎn)，說(shuō)明蛋白表達(dá)差異越大。本試驗(yàn)通過(guò)主成分析構(gòu)建反應(yīng)背最長(zhǎng)肌和臀肌兩個(gè)部位差異蛋白質(zhì)組的分析圖(圖3)，直觀地顯示了兩組分布在不同的區(qū)間，說(shuō)明背最長(zhǎng)肌與臀肌肌肉的蛋白質(zhì)組成有較大差異。

圖2 總蛋白搜庫(kù)結(jié)果Fig.2 Result of database search

圖3 主成分分析a、b分別代表背最長(zhǎng)肌和臀肌肌肉，1,2,3代表生物重復(fù)。Fig.3 Principal component analysisa and b represent the longissimus dorsi and gluteusmuscles respectively;1,2,3 represents biological duplication

2.4 背最長(zhǎng)肌肌肉和臀部肌肉差異蛋白鑒定

如圖4所示，烏珠穆沁羊肌肉差異蛋白火山圖，共篩選出背最長(zhǎng)肌和臀部肌肉的差異蛋白62個(gè)，在差異顯著的蛋白中上調(diào)為11個(gè)，下調(diào)為51個(gè)。

在上調(diào)的11個(gè)差異蛋白中分析了7個(gè)與肉品質(zhì)關(guān)系較大的蛋白，結(jié)果表明 ：在代謝方面Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1、Acyl-protein thioesterase 1及 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白主要參與長(zhǎng)鏈脂肪酸的激活、脂肪代謝及氨基酸的修飾與調(diào)控；在肌肉收縮方面Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein S6、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3 、蛋白主要參與肌肉運(yùn)動(dòng)，與鈣離子或肌動(dòng)蛋白結(jié)合，使ATP合成或水解，為肌肉運(yùn)動(dòng)供給能量；在肌球蛋白重鏈多態(tài)性方面值得注意的是Myosin-2 heavy chain是一種與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的蛋白，具有由肌動(dòng)蛋白激活的ATP酶活性，是肌纖維的組成性蛋白。

圖4 T檢驗(yàn)樹狀圖Fig.4 T test tree

3 討 論

本研究對(duì)烏珠穆沁羊肉總蛋白鑒定，在1%假陽(yáng)性條件下，共搜索到1003種蛋白質(zhì)與18667種肽段。2017年Wang等[16]對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肉蛋白鑒定獲得969個(gè)蛋白，4815個(gè)肽段， 應(yīng)用本技術(shù)獲得蛋白與iTRAQ技術(shù)一樣穩(wěn)定可靠。本研究篩選的上調(diào)蛋白共11個(gè)，其中7個(gè)是與肉品質(zhì)相關(guān)的特征性蛋白，在代謝功能方面的蛋白：β氧化是脂肪代謝的一個(gè)重要途徑，而肌內(nèi)脂肪的沉積又是影響肉品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵因素，例如fold change z中最高的蛋白Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1主要參與β氧化[17]，而Acyl-protein thioesterase 1直接參與脂肪代謝，眾所周知肌內(nèi)脂肪是影響肉品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，而Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 1和Acyl-protein thioesterase蛋白又與脂肪的代謝息息相關(guān)，所以這兩個(gè)蛋白通過(guò)影響肌內(nèi)脂肪的沉積而影響肌肉品質(zhì)。蛋白質(zhì)作為生理功能的執(zhí)行者[18]，蛋白組的變化可能與肉嫩度相關(guān)[19]，Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白其參與Ser/Thr-Pro修飾，并且在酪氨酸激酶的負(fù)調(diào)控中有至關(guān)重要的作用，絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸是蛋白質(zhì)的重要組成成分，氨基酸變化則影響蛋白質(zhì)的變化，Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1蛋白通過(guò)影響肌肉的嫩度從而影響肌肉品質(zhì)。在收縮功能方面的蛋白，Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3這些蛋白可以與兩個(gè)鈣離子或肌動(dòng)蛋白結(jié)合，與鈣離子共同作用于ATP，使ATP水解并釋放能量，或使肌動(dòng)蛋白具有激活A(yù)TP酶的能力。汪以真[20]研究顯示:ⅡB 型肌纖維含量高的肌肉, 易發(fā)生PSE肉。I 和ⅡA 型肌纖維( 屬于氧化型肌纖維)含量高的肌肉表現(xiàn)出更好的感官品質(zhì)。脂肪更易在這種類型的肌纖維肌肉中沉積, 并且因其含有較多的肌紅蛋白, 決定其肉質(zhì)更好。更有研究顯示紅肌纖維收縮速度較慢，而白肌纖維收縮速度快，若紅肌纖維含量高白肌纖維含量低則肉質(zhì)鮮美[21-22]，Parvalbumin alpha、30S ribosomal protein、Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 3蛋白作為在背最長(zhǎng)肌肉中上調(diào)的蛋白若參與ⅡA肌纖維運(yùn)動(dòng)，則其紅肌纖維含量高，肌內(nèi)脂肪沉積更多，則決定其肉質(zhì)更為鮮美； Myosin-2 heavy chain蛋白，是肌球蛋白重鏈異構(gòu)體，而肌原纖維由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白組成，肌球蛋白又由肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈及兩個(gè)亞基組成[23-24], Stephen[25]研究顯示不同肌球蛋白重鏈會(huì)組成不同肌纖維類型，故Myosin-2 heavy chain蛋白直接影響肌纖維組成，最終決定肌肉品質(zhì)。

4 結(jié) 論

1%假陽(yáng)性條件下，檢測(cè)到1003種蛋白質(zhì)與18667種肽段。選取差異系數(shù)大于2或小于0.05作為選取差異蛋白的閾值，差異顯著上調(diào)的蛋白有11個(gè)，下調(diào)為51個(gè)。上調(diào)的11個(gè)蛋白質(zhì)在UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并分析，發(fā)現(xiàn)相較于臀部肌肉，背最長(zhǎng)肌中有7個(gè)基因均與肌肉品質(zhì)相關(guān)，并成功鑒定到?jīng)Q定肉品質(zhì)的蛋白Myosin-2 heavy chain。