反芻動物瘤胃原蟲的化學感知及信號通路研究進展

崔爽青，李勝利，孫海洲，金 鹿，桑 丹，張春華，張崇志，邴新帥，白 剛

(1.內蒙古農業(yè)大學 內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)與飼料研究所，內蒙古 呼和浩特 010031；3.鄂爾多斯市農畜產品質量安全中心，內蒙古 鄂爾多斯 017000)

瘤胃微生物在反芻動物消化、健康和免疫過程中發(fā)揮著重要作用[1]，胃腸道微生物被視為反芻動物的一個“微生物器官”，提供給宿主所不具備的消化代謝植物纖維等營養(yǎng)物質的能力[2]。原蟲對小腸的蛋白質供應量已不同于以前低質粗飼料水平下建立模型的估測量，瘤胃原蟲在維持瘤胃內穩(wěn)態(tài)和為動物機體供應能量和蛋白質上發(fā)揮著重要作用。因此，瘤胃微生物特別是瘤胃原蟲的組成和營養(yǎng)代謝特點對于精準養(yǎng)殖有重要的借鑒意義。

1 瘤胃微生物與瘤胃發(fā)酵

瘤胃是一個十分復雜的厭氧微生物發(fā)酵系統(tǒng)，這個微生態(tài)體系包括不同的原核微生物(細菌和古菌)、真核微生物(原蟲和真菌)和噬菌體。這些微生物在瘤胃中主要占據(jù)著三個生態(tài)位：液相、食糜和消化道粘膜，75%以上的瘤胃微生物附著于瘤胃食糜和粘膜[3]。瘤胃中原蟲數(shù)量雖然比細菌少得多，但是由于其體積較大，在瘤胃中的生物量可以達到10%～50%[4]。瘤胃內的原蟲主要屬于纖毛蟲綱(Ciliates)均毛蟲科(Holotrichidae)的絨毛蟲屬(Dasytricha)和頭毛蟲科(Ophryoscolecidae)的雙毛蟲屬(Diplldinium)、內毛蟲屬(Entodinium)，其中以內毛蟲和雙毛蟲最多，約占纖毛蟲總數(shù)的85%～98%。

Russell[5]報道，在瘤胃微生物降解飼料過程中所產生的大量揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，經(jīng)瘤胃壁滲透進入血液吸收后，可為反芻動物提供50%～70%的能量需求。此外，反芻動物機體60%～70%的蛋白需求，是由外流出瘤胃的微生物提供的。Bach[6]指出，外流出瘤胃的微生物蛋白總量的多少，依賴于瘤胃內營養(yǎng)底物的可利用性以及瘤胃微生物對于這些營養(yǎng)底物的利用效率。多年以來，傳統(tǒng)的瘤胃代謝經(jīng)驗模型在反映營養(yǎng)物質降解過程的復雜性和提高其利用效率方面，進行了諸多有益嘗試。但不盡如意的是，這些模型受限于對不同日糧條件下瘤胃微生物蛋白產量及其外流量規(guī)律的認識不夠深入。

2 瘤胃內原蟲外流速率與蛋白質周轉

在當前奶牛和綿羊營養(yǎng)領域，Dijkstra模型(1994)[7]和康奈爾凈碳水化合物和蛋白質體系(CNCPS)[8]已被開發(fā)用來提高日糧營養(yǎng)物質的利用效率及減少氮向環(huán)境中的排放。需要指出的是，這些模型的建立都是基于這樣一個概念，即瘤胃內氮周轉(intra-ruminal N recycling)的增加是由于原蟲的大量自溶引起，并且假定原蟲很少甚至沒有外流出瘤胃。這些假設均建立在數(shù)量非常有限的體內(invivo)試驗觀測結果，有主觀臆斷之嫌，不免也就影響了這些模型對瘤胃代謝模擬的實效。Dijkstra 在其1994 提出的模型中，最初假定原蟲外流出瘤胃的速率是固相流通速率(kp)的一半；而CNCPS 體系則假定沒有原蟲外流出瘤胃[9]。1998 年版的Dijkstra 模型依據(jù)近幾年的大量報道，調高了此前版本所設定的原蟲外流速率[10]。Hook[11]研究指出，Dijkstra1998 版模型在此方面的認定是基于Bauchop與Clarke[12]在早期電子顯微鏡的研究結果，而且也未考慮吸附于瘤胃固相顆粒上的內毛原蟲量，如此一來出現(xiàn)了該模型低估了原蟲代謝池的大小。Dehority[13]和Williams[14]研究指出，眾多學者基于對飼喂后瘤胃等毛原蟲的行為研究結果，武斷地推測瘤胃中內毛原蟲亦有著相似的瘤胃“宅”(sequestration)現(xiàn)象。分析Prins等[15]在這方面的報道，發(fā)現(xiàn)這些推斷大多來源于體外批次培養(yǎng)的研究結果。在體外批次培養(yǎng)情況下，累積的高濃度乳酸能夠溶解原蟲細胞。Kebreab[16]撰文指出，目前基于原蟲自溶的瘤胃建模，很可能夸大了原蟲細胞在瘤胃內的真實自溶量。在這方面，F(xiàn)irkins[17]進一步指出，現(xiàn)有諸多模型版本中模擬原蟲代謝動力學，是完全基于綿羊和奶牛在低干物質采食量(DMI)情況下的研究結果；現(xiàn)實情況是，當奶牛DMI增加時，瘤胃固相外流速率(kp)也隨之增加，原蟲細胞外流向小腸的速率亦同步增加，瘤胃原蟲世代間隔會降低，原蟲生長效率加快；在上述兩方面的共同作用下，瘤胃內原蟲氮無效再循環(huán)將會降低；另外，原蟲的外流還很可能受到固相顆粒的“表面附著”(apparent attachment)影響。多年以前，Bauchop和Clarke[12]利用掃描電鏡技術，觀察到在綿羊瘤胃內前毛蟲屬(Epidinium)原蟲表面附著于飼草顆粒，并由此產生了“dogmas”這一瘤胃微生物學名詞，意指原蟲附著于飼料和顆粒。從Williams 與Coleman[14]在這方面詳盡研究的思路來看， Dehority[18]完全忽視了原蟲長期附著飼料顆粒的重要生物學意義。Sylvester[19]和Karnati[20]的研究指出，瘤胃內原蟲的外流速率幾乎與瘤胃固相kp相當。Sylvester等[21]在體外試驗中也指出，原蟲可根據(jù)轉化間隔調整其世代周期。

Dehority和Tirabasso[22]已充分研究揭示，等毛原蟲具有識別糖濃度梯度變化的感知作用。盡管他們的結果顯示，由分子的化學感知(chemosensing)到原蟲游動之間有一定的時間間隔，但這足以表明此現(xiàn)象與細胞間糖原濃度變化相關。Leick和Lindemose[23]曾用“化學增活(chemokinesis)”一詞用于強調四膜蟲(Tetrahymena)無方向性的隨機運動。當飼料被反芻動物攝入到瘤胃中時，諸多以糖類、氨基酸和肽等形式存在的化學感應因子亦隨之在瘤胃液中釋放。Williams和Coleman[14]報道，攝食后的奶牛瘤胃液中，等毛蟲的化學感知作用將隨著糖的降解和貯存而降低，并停留在瘤胃中部。Russell[5]報道，較細菌而言，氨基酸和肽對瘤胃原蟲生長的刺激作用更明顯。Dehority[13]注意到，在充足供應營養(yǎng)底物后，奶牛瘤胃內的等毛原蟲趨于下沉向性運動(ventral swimming)，當其采食完后背向運動(dorsal swimming)，并且在不同的日糧類型下整個種群內的絕大多數(shù)同步協(xié)作。這一點的研究對于瘤胃建模的意義非常重大，因為背向游動可增加等毛原蟲外流出瘤胃的機率。因此，對于內毛原蟲和等毛原蟲來說，瘤胃外流速率的增加勢必會加快其生長速率以補償增加的外流速率。

對于瘤胃原蟲的研究，主要集中于全部或部分驅除原蟲對于反芻動物消化代謝的影響。樊艷華[24]匯總了1962～2012年國內外關于瘤胃驅原蟲來提高反芻動物氮利用率的研究結果，總結得出驅原蟲后有機物、中性洗滌纖維和粗蛋白在整個消化道內的降解率都降低，有機物和中性洗滌纖維在瘤胃的降解率降低，瘤胃pH、NH3-N以及VFA降低，微生物蛋白的合成效率增加。Mosoni等[25]研究發(fā)現(xiàn)，短期(10周)驅原蟲后分解纖維的菌群減少，日糧中纖維物質的降解率降低，產甲烷菌減少，甲烷排出降低；而長期(2年)驅原蟲后分解纖維的菌群和產甲烷菌都增加。韓春艷等[26]、秦煒賾等[27]、經(jīng)語佳等[28]和趙士萍等[29]近年來也進行了驅除原蟲實驗，得到了與之前學者類似的結果。驅除原蟲對反芻動物來講有利有弊，但他們都沒有考慮原蟲蛋白對反芻動物小腸蛋白質的貢獻。

3 瘤胃內原蟲化學感知信號通路

反芻動物對氮的利用率只有20%～35%，集約化牛羊養(yǎng)殖場相當關注N的利用效率，因為這直接關系著養(yǎng)殖成本和環(huán)境壓力。有鑒于此，國內外學者相繼開發(fā)了諸如Dijkstra[10]和CNCPS等[8]知名模型并廣泛使用。這些模型對微生物N的外流速率及其外流小腸量的估測是既不準確又不精確的，特別是對瘤胃中非液相階段的原蟲數(shù)量幾乎未知。正如Firkins等[30]指出的，這些缺憾擴大了對代謝蛋白質(metabolizable protein，MP)量預測的邊際錯誤。生產實踐中，為避免MP預測錯誤，牧場主往往采用過量飼喂飼料蛋白質的“矯枉過正”做法，造成N利用率下降、寶貴的蛋白飼料資源浪費和環(huán)境污染。

多年來，國際上一些學者對非瘤胃原蟲的營養(yǎng)化學感知作用及細胞信號轉導，進行了非常有益的探索，很有借鑒意義。Keizer-Gunnink等[31]和Leick等[32]報道，cGMP依賴性蛋白激酶G(PKG)與纖毛膜化學感應相關，可刺激纖毛蟲細胞生長；阻斷cGMP激活的PKG，可導致纖毛蟲的游動時間越長。Satir[33]指出，在這種因營養(yǎng)梯度改變而發(fā)生的信號介導中，cAMP的水平升高與蛋白激酶A(PKA)和鈣調素活性增加關聯(lián)。Fukami等[34]發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)化學感知因子的誘導下，單細胞真核生物其細胞內相對比胞外能適應更高的Ca2+濃度。Bartholomew等[35]對四膜蟲的研究發(fā)現(xiàn)，一些鈣依賴過程如β-微管蛋白(β-tubilin)的鈣調蛋白激活磷酸化可介導纖毛逆轉。Leick和Lindemose[23]認為，葡萄糖和氨基酸營養(yǎng)的化學感知作用，可激活原蟲磷脂酰肌醇3-P 激酶(PI3K)-TOR 信號通路，促進纖毛運動和相應增加養(yǎng)分消化過程中的有效性。另外，相關研究亦顯示，蛋白激酶G(protein kinase G) 參與細胞膜信號傳導。

Lampert等[36]建立了非瘤胃纖毛原蟲化學感知作用和囊泡轉運及傳遞模型。在這一模型中，磷脂酰肌醇3-P激酶、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、蛋白激酶C、、二?；视?、肌醇1,4,5-三磷酸、亞硝基鐵氰化鈉(sodium nitropusside)、渥曼青霉素(wortmanin)、胰島素(insulin)等參與了調節(jié)作用，其中渥曼青霉素為PI3K的抑制劑，胰島素可以解救(rescue)渥曼青霉素對PI3K抑制作用，亞硝基鐵氰化鈉能夠激活鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase)最終活化蛋白激酶G，染料木黃酮(genistein)為受體酪氨酸激酶的阻斷劑。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一個包括許多脂質激酶的家族，由1個調節(jié)亞基(P85)和1個催化亞基(P110)組成。mTORC1是mTOR的復合物之一，是一種重要的信號調控分子, 它通過磷酸化作用調控細胞內mRNA的翻譯,參與膜蛋白轉運、蛋白質降解、蛋白激酶C信號轉導和核糖體合成。mTORC1可以對氨基酸、激素、生長因子、葡萄糖產生應答。它們通過mTORC1 信號傳導通路調節(jié)S6K1(ribosomal protein S6 kinase)和4E-BP1 (eukaryoticinitiation factor 4Ebinding protein 1)的磷酸化, 進而從翻譯水平上調節(jié)基因表達。在細胞中，胰島素及胰島素樣生長因子通過其受體及胰島素受體底物激活PI3K/AKT/mTORC1通路，而其他生長因子多通過E-Ras激活PI3K/AKT/mTORC1通路。磷酸酶基因(PTEN)使磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)的D3位去磷酸化以抑制在PI3K的催化下磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)向PIP3的轉變。AKT在PIP3作用下向細胞膜轉位，繼而被PI3K激活的PI3K依賴性激酶1(PDK1)同時磷酸化激活，直接磷酸化激活mTORC1。磷酸化的AKT還可以使TSC2磷酸化，抑制TSC2的活性，加速TSC1與TSC2的降解，這個過程引起mTORC1在TSC1-TSC2復合物抑制的狀態(tài)下釋放，從而激活mTORC1，增強其信號傳導通路。激活的mTORC1通過調節(jié)下游因子作用于基因的調控。

通過對非瘤胃原蟲對碳水化合物和肽的化學感知作用的研究表明，瘤胃原蟲這一單細胞真核生物存在營養(yǎng)化學感應(nutrient chemosensing)機制,并通過PI3K/AKT/mTORC1通路實現(xiàn)復雜的細胞通信與感應，以此來保障瘤胃發(fā)酵和機體穩(wěn)衡控制(homeostasis)。營養(yǎng)化學感應機制，是指通過營養(yǎng)物質及其代謝產物與細胞膜或細胞內受體結合, 或營養(yǎng)物質載體跨膜運輸引起細胞體積和細胞膜電勢的變化。這些營養(yǎng)物質感應受體能夠引起細胞信號傳導系統(tǒng)的級聯(lián)反應，最終導致大量蛋白質表達和活性的改變。

瘤胃微生物把瘤胃發(fā)酵飼料產生的能量用于自身的生長、維持、貯存糖原和能量溢出。能量的主要流向與微生物的生長效率和飼料的營養(yǎng)利用效率密切相關。在高精料日糧條件下，原蟲可以將用于生長和維持以外多余的碳水化合物合成儲備碳水化合物(貯存糖原)，供日后動員使用或直接流到小腸被動物機體吸收。另外，在碳水化合物嚴重過剩時將發(fā)生能量溢出[37]。原蟲的自身維持和能量溢出不可逆地消耗ATP，減少了可用于蛋白質合成的ATP，相比之下儲備碳水化合物存在著合成和降解的可逆關系，成為細胞內的ATP的“緩沖池”(如圖1)。在生物界中，藍藻也存在類似的“溢出代謝”現(xiàn)象[38-40]。藍藻中的糖原合成和使用，是適應光和養(yǎng)分可用性變化的常見機制，其糖原合成與光合作用和由glgC基因(slr1176)編碼的關鍵酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)有關。這對于研究瘤胃原蟲對小腸蛋白質的貢獻，提高能量利用率，重新準確評估機體的能量利用率，有很大啟發(fā)。

圖1 瘤胃微生物ATP能量分配到生長功能、非生長功能和儲備碳水化合物Fig.1 Partitioning of ATP toward growth functions, non-growth functions, and synthesis of reserve carbohydrate

4 小 結

在現(xiàn)在高精料的飼養(yǎng)條件下，原蟲的生物量隨之提高[41]，而瘤胃原蟲可以貢獻高達50%的微生物生物量[42]，這使其成為流出瘤胃的微生物蛋白的重要組成部分。沿用以前低質粗飼料條件下微生物對小腸蛋白質的供應量的估測方法，低估了瘤胃原蟲對小腸蛋白的供應量，造成了飼料粗蛋白的過量供給，從而造成寶貴的蛋白飼料資源浪費和環(huán)境污染。研究瘤胃內原蟲對各種營養(yǎng)物質化學感知作用，以及內毛原蟲、纖毛原蟲等不同種屬原蟲對于不同信號傳導調節(jié)劑感受差異以及相關分子機制，將有助于了解在瘤胃內原蟲在微生物功能中的重要作用，更好地預測瘤胃氮循環(huán)，減少糞尿氮的排放，提高反芻動物氮的利用率。