APPL1在肺癌組織中的的表達及其與EGFR的關(guān)系＊

朱贊雷 ，陳碧嬛 ，王建 ，張敏 ，樂永宏 ，賴慶文

(江西省贛州市人民醫(yī)院，1、呼吸科；2、心內(nèi)科；3、病理科；4贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸科，贛州 341000)

肺癌是人類健康最具有威脅的殺手之一。在我國，肺癌的發(fā)病率、死亡率已經(jīng)成為所有惡性腫瘤之首，其中在男性兩者均是居第一位，而在女性發(fā)病率為第二位（低于乳腺癌），但死亡率居第一位[1]。由于肺癌早期時癥狀少，甚至沒有癥狀，臨床治療效果差，5年存活率低。因此，尋找新的診斷方法及新的治療靶點，能讓我們在早期診斷及靶向治療方面看到新的方向。APPL1(Adaptor protein containing PH domain，PTB domain and leucine zipper motif 1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一個銜接蛋白、調(diào)節(jié)蛋白，介導脂聯(lián)素的信號轉(zhuǎn)導。它不但參與了葡萄糖和脂類的代謝，而且參與了脂連素介導的肥胖相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如肝細胞肝癌。同時，APPL1接受細胞外表皮生長因子和氧化應激的刺激，與Rab5a在內(nèi)涵體上相互結(jié)合，將生長增殖信號轉(zhuǎn)導至細胞核內(nèi)，進而引起基因表達的變化。APPL1在脂聯(lián)素信號轉(zhuǎn)導方面、2型糖尿病、結(jié)腸癌、乳腺癌[2]、肝癌等方面的研究已成為最近國外研究的熱門，但是關(guān)于其與肺癌的關(guān)系的研究甚少。為了明確APPL1在肺癌組織中的表達及其與EGFR表達的關(guān)系，我們對50例肺癌組織及50例癌旁組織進行免疫組化檢測，現(xiàn)報告如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集贛州市人民醫(yī)院2012年3月-2014年10月手術(shù)切除、有病理依據(jù)的肺癌的標本50例，對照組為距腫瘤邊緣5cm處癌旁正常組織。所有肺癌病例均為原發(fā)性肺癌，經(jīng)彩超、CT、電子支氣管鏡等檢查排除轉(zhuǎn)移性肺癌，排除感染性病灶。其中男41例，女9例，平均年齡（59.64±9.44）歲(36-75歲)；病理分型：腺癌 25例，鱗狀細胞癌21例，小細胞癌4例；TNM分期：I期16例、Ⅱ期20例、Ⅲ期12例、Ⅳ期2例；術(shù)前未經(jīng)過放、化療以及靶向治療。臨床分期標準參考2009 IASLC國際肺癌分期(第七版)[3]。所用標本均為手術(shù)切除的大標本，將距腫瘤邊緣5cm處肺組織作為正常組織對照；兩組分別經(jīng)4%甲醛液固定，然后石蠟包埋，3um連續(xù)切片等待免疫組織化學實驗。

1.2 方法 免疫組織化學檢測：應用Envision免疫組化法，兔抗人APPL1多克隆抗體（ab128591）為美國Abcam公司產(chǎn)品，兔抗人EGFR多克隆抗體為福州邁新公司產(chǎn)品。用已證實的APPLl陽性片（胎兒心臟組織的免疫組化片）作為陽性對照；用PBS緩沖液來代替一抗，作為陰性對照。分別檢測APPLI蛋白和EGFR蛋白在肺癌細胞以及癌旁正常組織細胞中的分布、定位以及表達強度。APPLl陽性染色為細胞胞漿中的棕黃色顆粒。綜合考慮免疫組化的細胞陽性強度及細胞陽性率，采用半定量積分進行分級，積分=染色細胞陽性率x染色強度。每張染色切片中隨機選取5個高倍鏡視野(10×40)，取每個視野中計數(shù)200個細胞。判斷標準： 染色細胞陽性率：＜5%、6%-20%、21%-50%、＞50%分別計0分、1分、2分、3分；染色強度：無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計0分、1分、2分、3分；2 種計分相乘，0 分陰性（-），1-3 分弱陽性（+），4-6陽性（++），7-9強陽性（+++）。 EGFR 標記以細胞漿和細胞膜出現(xiàn)了棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，腫瘤細胞比率＞10%為陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18．0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計，肺癌組織中與癌旁正常組織中APPL1的表達陽性率比較采用卡方檢驗，P＜0．05認為差異有統(tǒng)計學意義。APPL1在肺癌的表達與患者的年齡、性別、腫瘤分期、組織學類型的分析，采用秩和檢驗，P＜0．05認為差異有統(tǒng)計學意義。APPL1和EGFR在肺癌組織中的表達之間相關(guān)性的分析，采用 Spearman 秩和相關(guān)分析，P＜0．05， 有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 APPL1在肺癌組織及癌旁正常組織中的表達情況 本實驗中50例肺癌組織中有35例呈不同程度的陽性表達，表達陽性率為70%(35/50)。而癌旁正常組織中APPL1陽性表達率為16%(8/50)，表達明顯低于肺癌組，肺癌組織與癌旁正常肺組織組之間陽性表達率差異比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0．001)（見表 1）。

表1 肺癌組織與正常組織APPL1表達的比較

2.2 APPL1在肺癌組織中不同臨床病理特征的表達情況 組織學類型：陽性率：腺癌64%（16/25）；鱗癌76.19%(16/21)；小細胞癌75%(3/4)。3組樣本按不同的表達程度，采用秩和檢驗，P值＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。臨床分期：分別統(tǒng)計不同組織類型肺癌各臨床分期的APPL1的陽性表達，采用秩和檢驗，P值＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。性別：分別統(tǒng)計不同性別的肺癌組織中APPL1的陽性表達，采用秩和檢驗，P值＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。年齡：分別統(tǒng)計不同年齡（分＜60歲和＞=60歲兩組）的肺癌組織中APPL1的陽性表達，采用秩和檢驗，可見P值＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。（見表2）

2.3 APPL1與EGFR在肺癌組織中的表達情況的比較 分別統(tǒng)計肺癌組織中EGFR與APPL1的陽性表達，采用Spearman秩和相關(guān)分析相關(guān)性，結(jié)果見表中可見P值＜0.05（在置信度 （雙測）為0.05時，相關(guān)性是顯著的），差異有統(tǒng)計學意義，說明APPL1與EGFR在肺癌中的陽性率存在一致性，兩者在肺癌中的表達可能存在相關(guān)（見表3）。

3 討論

APPLl是近年發(fā)現(xiàn)的一種介導脂聯(lián)素信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)蛋白。APPLl由709個氨基酸組成，基因定位于染色體3p14.3-p21.1，包含有22個外顯子和21個內(nèi)含子，其全長45．6kb，包含氨基端的PH(Pleckstrin homology)結(jié)構(gòu)域、BAR (Binamphiphysin-Rvs)結(jié)構(gòu)域和羧基端的磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)結(jié)構(gòu)域[4]。脂聯(lián)素水平的減少已經(jīng)在多個疾病中觀察到，諸如2型糖尿病，肥胖的各種臨床疾病中觀測，胰島素抵抗[5，6]，心血管疾病[7]和高血壓[8]。

APPL1由BAR、PH以及PTB三個多功能結(jié)構(gòu)域組成[9]，通過不同的結(jié)構(gòu)域選擇性的與多膜受體、胞內(nèi)信號分子相互作用，在細胞膜與細胞質(zhì)之間進行著信號傳遞，參與細胞的生長、增殖和分化。

本研究結(jié)果表明APPL1在肺癌組織中的表達具有較高的陽性率，肺癌組織與癌旁正常肺組織組之間陽性表達率差異比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0．001)，有望成為一種新的免疫標志物，或可應用于肺癌的臨床免疫組化診斷和鑒別診斷，或者成為一個新的治療靶點。本實驗研究了肺癌患者年齡、性別、組織學類型及臨床分期等臨床病理特點與APPL1的關(guān)系。結(jié)果表明APPL1與患者年齡、性別、臨床分期、無顯著相關(guān)性(P＞0．05)，而 APPL1 與EGFR在肺癌中的表達有相關(guān)性（P＜0.05）。

表2 APPL1在肺癌組織中不同臨床病理特征的表達比較

表3 肺癌APPL1與EGFR測定結(jié)果的比較

表皮生長因子受體(EGFR)家族被證實與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，廣泛分布在人體各組織細胞膜上的一種多功能糖蛋白，是酪氨酸激酶信號通路上的一個重要分子。肺癌中EGFR有著較高的分布及表達已經(jīng)得到了大量資料充分證實，之前就有研究顯示，45-85%非小細胞肺癌患者中存在EGFR的過度表達或者異常激活[10]。APPL1是EGF信號轉(zhuǎn)導途徑的下游效應因子，研究證實，在EGF的刺激下，APPL1調(diào)節(jié)EGFR的蛋白水平，APPL1的表達與EGFR的蛋白水平呈正相關(guān)[11]。Miaczynska M等實驗證實，APPL1和APPL2是Rab5的兩個新的效應體，接收EGF的信號，APPL1與Rab5的相互作用來調(diào)節(jié)細胞的增殖，APPL1與Rab在內(nèi)吞運輸中的信號轉(zhuǎn)導中的作用具有至關(guān)重要的意義[12]。本實驗證實APPL1在肺癌組織中高表達，且同時與EGFR在肺癌組織中的表達相關(guān)，這或許能成為肺癌診斷及治療的新的切入點，提供新的思路。