不同產(chǎn)地野生桑黃中總黃酮含量比較

胡碧輝

寧波市奉化區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，浙江 寧波 315500

桑黃又名桑臣、桑耳、胡孫眼、桑黃菇等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，早在兩千多年前就已經(jīng)作為名貴中藥材使用[1]。桑黃可利五臟、軟堅(jiān)、止血、活血、和胃止瀉，主治淋病、崩漏帶下、癥瘕積聚、癖飲、脾虛泄瀉。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，桑黃在抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、保護(hù)肝臟等方面均具有確切的療效[2～4]，起效的物質(zhì)基礎(chǔ)多指向黃酮和多糖兩類物質(zhì)，而總黃酮的含量影響著桑黃的質(zhì)量[5]。野生桑黃素有“森林黃金”之稱，隨著桑黃被越來越多的人追捧，野生桑黃的數(shù)量正在急劇減少。桑黃在我國東北、華北、西北、華東等地均有分布，地域環(huán)境不同，桑黃的質(zhì)量也存在差異，本研究以總黃酮含量為觀察指標(biāo)，比較全國6個(gè)主要產(chǎn)地野生桑黃的質(zhì)量，以期能為野生桑黃的保護(hù)和合理開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與藥品

1.1 儀器 UV-1800紫外分光光度計(jì)(島津公司)；HH.S11-4型電熱恒溫水浴鍋(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；XS205十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ME4002T百分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-250GTDV型超聲波清洗器(上海精密儀器儀表有限公司)；KDM型電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；XL-04B搖擺式粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-B95型真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；BT300-2J恒流泵(保定蘭格恒流泵有限公司)。

1.2 試劑與藥品 蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，含量92.6%，批號(hào)：100080-201610)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水(自制)；AB-8型大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)；野生桑黃為2017年10—11月分別采自吉林長白山、山東夏津、西藏昌都、云南臨滄、安徽金寨、四川甘孜6地，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張水利教授鑒定為多孔菌科真菌火木層孔菌Phellinus igniarius(L.exFr.)Quel.的子實(shí)體。

2 研究方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的提取及純化[6～7]取桑黃200 g，置搖擺式粉碎機(jī)中粉碎成中粉，混合均勻，取20 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入70%乙醇500 mL，浸泡30 min，回流提取60 min，濾過，收集濾液，用70%乙醇100 mL洗滌濾渣，合并濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中回收乙醇至無醇味，備用。取100 g經(jīng)預(yù)處理的AB-8型大孔吸附樹脂，濕法裝柱(2.7 cm×16 cm)。將上述備用樣品上柱，靜置1 h，先用3 BV的純化水洗脫，再用5BV 70%乙醇以2 BV/h的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，加70%乙醇定容至500 mL，搖勻，即得純化后的桑黃總黃酮。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取蘆丁對(duì)照品約20mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至100 mL，搖勻，即得濃度為0.2104mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 分別取不同產(chǎn)地的桑黃，按照2.1項(xiàng)下方法制備桑黃總黃酮液，然后精密量取10 mL，置于100 mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至100 mL，搖勻，即得。

2.4 線性范圍考察[8]精密吸取對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加70%乙醇至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，加乙醇至100 mL，搖勻，放置15 min，以第1管作為空白，在507 nm處測定吸光度，結(jié)果見表1。以蘆丁量(mg)為橫坐標(biāo)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.635X-0.048，r=0.998 9。結(jié)果表明，蘆丁在0.210 4～1.052 0 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液3.0 mL，按照2.4項(xiàng)下方法操作，重復(fù)測定6次，RSD=0.15%，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液3.0 mL，按照2.4項(xiàng)下方法操作，每隔10 min測定1次吸光度，連續(xù)測定6次，RSD=0.18%，見表3。結(jié)果表明，供試品溶液顯色后在50 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液3.0 mL，共6份，分別按照2.4項(xiàng)下方法操作，測定吸光度，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，本含量測定方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(黃酮含量：0.240 3mg/mL)1.5 mL，共6份，分別置于25 mL量瓶中，精密加入蘆丁對(duì)照品溶液(0.210 4 mg/mL)1.7 mL，其余按照2.4項(xiàng)下方法操作，測定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，本含量測定方法回收率良好。

表5 加樣回收率試驗(yàn)

2.9 不同產(chǎn)地桑黃總黃酮含量測定 取不同產(chǎn)地的桑黃，按2.1項(xiàng)下方法制備黃酮提取液，按照2.4項(xiàng)下方法操作，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的桑黃總黃酮含量不同，含量為37.6～62.2 mg/g不等。從收集到的樣品來看，吉林長白山、西藏昌都所生的桑黃總黃酮含量較高，云南臨滄、四川甘孜所生的桑黃總黃酮含量略低。

表6 不同產(chǎn)地桑黃總黃酮含量測定(n=3)

3 討論

桑黃子實(shí)體堅(jiān)硬，在粉碎前需要先用斧頭砍成小塊，才能有利于搖擺式粉碎機(jī)粉碎。試驗(yàn)過程中，筆者對(duì)比了熱回流提取和超聲提取，結(jié)果顯示，熱回流提取能充分地對(duì)黃酮進(jìn)行提取，而超聲提取率僅為73%，分析原因?yàn)樯｜S子實(shí)體的組織和細(xì)胞堅(jiān)實(shí)而又具有一定的韌性，超聲引起的溶劑分子空爆不足以破壞組織和細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)部的黃酮提取率較低，而回流提取熱溶劑的穿透性和溶解性大大提升[9]，確保提取充分。

紫外分光光度法較高效液相色譜法有優(yōu)勢(shì)，可以利用一種對(duì)照物質(zhì)來測定一大類物質(zhì)的含量，而且測試成本更低；但紫外分光光度法較高效液相色譜法也有劣勢(shì)，即顯色機(jī)理的專屬性差，供試品中的其他成分容易干擾顯色反應(yīng)，從而影響測試結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此，為提高檢測的準(zhǔn)確性，應(yīng)采用理化手段提高待測組分的純度[10]。而黃酮純化最常用到的AB-8型大孔吸附樹脂，可將黃酮提取液的純度由20%提升到60%，大大提高了檢測的準(zhǔn)確性。

近些年掀起的桑黃熱導(dǎo)致野生桑黃的價(jià)格一路飛漲，部分地區(qū)尋采野生桑黃者趨之若鶩，使得本就數(shù)量不多的野生桑黃越來越少。隨著現(xiàn)代微生物培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)桑黃子實(shí)體的人工培育，但是限于技術(shù)的成熟度而未能推廣[11]。農(nóng)林等相關(guān)部門應(yīng)助力桑黃人工培育的發(fā)展，從根本上解決桑黃藥源問題。除此之外，還應(yīng)當(dāng)出臺(tái)相應(yīng)的政策加強(qiáng)對(duì)野生桑黃的保護(hù)，禁止濫采，這將有助于野生桑黃的自然繁育和規(guī)模的擴(kuò)大。

不同產(chǎn)地的野生桑黃總黃酮含量有差異，這與不同產(chǎn)地的溫度、光照、水分、土壤等因素有密不可分的關(guān)系[12]。黃酮含量的高低，僅可作為桑黃質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)之一，若要全面地評(píng)價(jià)桑黃質(zhì)量，還應(yīng)當(dāng)對(duì)多糖、三萜、微量元素等展開系統(tǒng)的研究。