單鏈抗體的開發(fā)與應(yīng)用

柴小龍，袁毅君，馬玉鳳，趙 娣

(1.天水市秦州區(qū)口腔醫(yī)院，甘肅 天水 741000；2.天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

動(dòng)物免疫系統(tǒng)中抗體扮演了十分重要的角色，能夠與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，從而維持動(dòng)物體的穩(wěn)態(tài)，[1]所以，至今仍然有許多人在為抗體的制備和純化而努力。自從人們?cè)趧?dòng)物機(jī)體中發(fā)現(xiàn)抗體以來(lái)，對(duì)于它的研究就一直沒(méi)有停止過(guò)，為了將其大規(guī)模地應(yīng)用到醫(yī)學(xué)治療方面，科學(xué)家們研究并制備出了多克隆抗體；[2]緊接著為了得到特異性較強(qiáng)及較純的抗體，又制備出了單克隆抗體，但也存在著生成的抗體只針對(duì)1種抗原決定簇，比較單一等不足之處；[3]最后為了克服單克隆抗體鼠源性強(qiáng)的缺點(diǎn)，制備出了基因工程抗體。現(xiàn)在，人們利用基因工程技術(shù)制備抗體，利用人抗體的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗體的序列，成功克服了因鼠源性抗體免疫原性太高而帶來(lái)的一些不便之處。[4]單鏈抗體屬于基因工程抗體的一種，首先通過(guò)PCR技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體基因，然后將其導(dǎo)入展示系統(tǒng)中進(jìn)行展示和篩選，最后轉(zhuǎn)入表達(dá)系統(tǒng)(通常為大腸桿菌)中進(jìn)行批量制備。[5]單鏈抗體的本質(zhì)是人工合成小分子抗體，因?yàn)槠鋬H有整個(gè)抗體的一條鏈，所以被稱為單鏈抗體。

1 單鏈抗體的起源

從細(xì)胞工程抗體到基因工程抗體，從細(xì)胞水平到基因、分子水平，抗體的制備技術(shù)一代比一代完善、成熟。目前為止，利用基因工程技術(shù)制備的抗體有：嵌合抗體、改形抗體、單鏈抗體、噬菌體抗體、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物抗體等，[6]其中單鏈抗體在近幾年發(fā)展迅速，被很多行業(yè)所應(yīng)用，可以說(shuō)是新起之秀，在未來(lái)有很大的發(fā)展空間。

相關(guān)研究人員最早在駱駝科動(dòng)物的血清中發(fā)現(xiàn)了單鏈抗體，后來(lái)在鯊魚和鰩魚等軟骨魚類的體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有單鏈抗體的存在。[7]單鏈抗體(single chain antibody fragment,scFv)，是由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)經(jīng)由15～20個(gè)氨基酸的短肽毗連而成。與傳統(tǒng)抗體相比，單鏈抗體存在如下幾方面的優(yōu)勢(shì)：容易滲透進(jìn)腫瘤組織中；免疫源性小，可消除人抗鼠的排異反應(yīng)；半衰期短，容易清除，利于解毒排出。[8]但同樣也存在缺點(diǎn)：穩(wěn)定性低、功能單一、親和力低等。

單鏈抗體作為第三代抗體(基因工程抗體)的一種，受到人們的廣泛關(guān)注，按時(shí)間先后順序依次出現(xiàn)了：?jiǎn)蝺r(jià)單鏈抗體、單鏈抗體多聚體和雙特異性單鏈抗體。

1.1 單價(jià)單鏈抗體

單價(jià)單鏈抗體的主要特點(diǎn)是：只具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，只能與一個(gè)抗原決定簇特異性結(jié)合，是目前研究出來(lái)的最簡(jiǎn)單的單鏈抗體。1988年，Bird和Huston等第一次將單鏈抗體研制出來(lái)，他們首先利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出具有雜交瘤細(xì)胞特性的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，然后用寡核苷酸(能夠編碼彈性短肽)連接起來(lái)，最后插入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象，其抗原親和性幾乎與完整抗體相同的單鏈抗體。[9]1990年，Chaudhary等成功地制備出了免疫毒素。[10]在以后的十幾年時(shí)間里，相關(guān)研究人員進(jìn)一步嘗試用一些真核生物或植物進(jìn)行表達(dá)并獲得成功。

1.2 單鏈抗體多聚體

因?yàn)閱蝺r(jià)單鏈抗體存在局限性，科學(xué)家們又研制出能與多個(gè)抗原決定簇特異性結(jié)合的單鏈抗體，稱為單鏈抗體多聚體。相關(guān)研究認(rèn)為[11]：隨著連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(Linker)長(zhǎng)度的變短，會(huì)依次形成二價(jià)二聚體、三價(jià)三聚體等單鏈抗體多聚體。

1.3 雙特異性單鏈抗體

經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，可以將兩種來(lái)源不同的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因連接，進(jìn)而讓其表達(dá)出兩種可以與不同特異性抗原結(jié)合的分子，這樣的單鏈抗體具有雙特異性。雙特異性單鏈抗體具有能與特異性抗原結(jié)合；降低與某些細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性；因不需要進(jìn)行細(xì)胞雜交，提高了制備效率等優(yōu)點(diǎn)。[12]1993年Holliger等最先制備出了雙特異性單鏈抗體。[13]

表1 單鏈抗體發(fā)展歷程中3種類型的優(yōu)缺點(diǎn)比較[5]

2 單鏈抗體的制備

圖1 單鏈抗體的制備流程[1]

如圖1所示：制備單鏈抗體時(shí)，首先利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，然后用Linker連接起來(lái)，緊接著導(dǎo)入展示系統(tǒng)中進(jìn)行展示和篩選，最后轉(zhuǎn)入表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行批量生產(chǎn)。

2.1 單鏈抗體的展示系統(tǒng)

展示系統(tǒng)，顧名思義它的作用就是對(duì)構(gòu)建好的單鏈抗體基因進(jìn)行展示和篩選，以達(dá)到觀察清晰及檢測(cè)是否達(dá)標(biāo)的目的。這是單鏈抗體的制備過(guò)程中十分關(guān)鍵的一步，因此有必要詳細(xì)闡述一下。目前為止，單鏈抗體的展示系統(tǒng)主要有以下三種。

2.1.1 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的單鏈抗體制備技術(shù)。[14]利用噬菌體展示技術(shù)制備單鏈抗體時(shí)，首先獲得噬菌體的蛋白質(zhì)編碼基因，然后利用基因工程技術(shù)，使單鏈抗體片段與其基因片段相連接，因?yàn)槭删w的蛋白質(zhì)存在于表面，所以間接的單鏈抗體就會(huì)在噬菌體表面進(jìn)行表達(dá)，有利于單鏈抗體的篩選及鑒定。胡小麗等[15]從大容量甲狀腺髓樣癌(MTC)人原噬菌體單鏈抗體庫(kù)中篩選出特異性的抗MTC單鏈抗體，并鑒定了其生物學(xué)特性；王建平等建立了人源性阿爾茨海默病(AD)噬菌體單鏈抗體庫(kù)，為篩選β-淀粉樣蛋白的人源性抗體提供了可靠保障；馮榮虎等創(chuàng)立了兔天然抗體庫(kù)，再一次證明了噬菌體展示技術(shù)的可靠性。

2.1.2 核糖體展示技術(shù)

核糖體展示技術(shù)具有展示速度快、親和力高以及可在體外篩選等優(yōu)點(diǎn)。首先使新生單鏈抗體與其mRNA連接形成復(fù)合物，再使與抗原具有高度親和性的mRNA進(jìn)行富集，最后通過(guò)PCR反轉(zhuǎn)錄得到擴(kuò)增產(chǎn)物。但在此過(guò)程中若沒(méi)有對(duì)DNA聚合酶進(jìn)行功能校對(duì)，則容易發(fā)生基因突變。[16]

2.1.3 酵母表面展示技術(shù)

酵母表面展示技術(shù)對(duì)于篩選具有高特異性和高親和力單鏈抗體十分有效，但由于酵母轉(zhuǎn)化效率過(guò)低延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)周期，從而限制了篩選抗體的產(chǎn)量和種類。該技術(shù)的最終目的是使重組蛋白連接到酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁上。例如，蛋白質(zhì)可以通過(guò)與α-凝集素黏附受體融合展示在酵母菌細(xì)胞壁上。[17]酵母表面展示技術(shù)主要利用了酵母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使重組蛋白能夠準(zhǔn)確折疊。

表2 單鏈抗體3種展示技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)比較[6]

2.2 單鏈抗體的表達(dá)系統(tǒng)

2.2.1 原核生物表達(dá)系統(tǒng)

原核生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，經(jīng)常被用作單鏈抗體的表達(dá)載體。大腸桿菌作為原核生物的典型代表，具有生長(zhǎng)速度快、價(jià)格低廉、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，很適合單鏈抗體的長(zhǎng)期大規(guī)模生產(chǎn)。[18]Mill?er等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌是所有單鏈抗體表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)速度最快的。目前主要有包涵體表達(dá)和分泌性表達(dá)這兩種表達(dá)方式，其中包涵體表達(dá)雖然速率更快，成功率更高，但是產(chǎn)生的抗體分子沒(méi)有抗原結(jié)合活性，這點(diǎn)分泌性表達(dá)就很好地彌補(bǔ)了。除此之外，科學(xué)家們也曾嘗試將其它的原核生物作為單鏈抗體的表達(dá)系統(tǒng)，但結(jié)果不太理想。綜合各種因素，大腸桿菌作為單鏈抗體的表達(dá)系統(tǒng)是最早被使用，目前研究最清楚，最實(shí)惠，最適合大規(guī)模生產(chǎn)的，是許多工廠的首選，是目前應(yīng)用最廣泛的。

2.2.2 真核生物表達(dá)系統(tǒng)

原核生物表達(dá)系統(tǒng)普遍存在著表達(dá)不夠徹底的問(wèn)題，不能很好地將一些抗體分子片段完整的連接起來(lái)。針對(duì)這一現(xiàn)狀，科學(xué)家們想到了利用真核生物。[19]在不斷地摸索試驗(yàn)中，人們發(fā)現(xiàn)酵母是所有真核生物中最適合作為單鏈抗體表達(dá)系統(tǒng)的，它不但能夠彌補(bǔ)原核生物表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，而且成本低、產(chǎn)量大、效益高。[20]相關(guān)研究者還發(fā)現(xiàn)：酵母的糖基化方式與高等真核生物極其相似，且還有很大的研究空間，有更多的潛能值得被挖掘。[21]除此之外，還有一些昆蟲、哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可作為單鏈抗體表達(dá)系統(tǒng)。

2.2.3 植物表達(dá)系統(tǒng)

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)植物的一些組織、器官也可被用于單鏈抗體的表達(dá)。比如，1992年，Weran等發(fā)現(xiàn)單鏈抗體可以在轉(zhuǎn)基因煙草中進(jìn)行表達(dá)，并且其作用可延續(xù)到下一代。轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)疫苗方面應(yīng)用廣泛。

如1989年，Hiatt等首次利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)抗體：在植物體內(nèi)，兩個(gè)重組基因產(chǎn)物能夠正確折疊、組裝成與脊椎動(dòng)物來(lái)源有相同功能的異二聚體抗體。1990年，Daring等利用轉(zhuǎn)基因煙草成功表達(dá)了具有生物活性的重組抗體(IgM)。1991年，Benvenuto等在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)了重鏈可變區(qū)(VH)片段。1993年，F(xiàn)irek等在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)了單鏈Fv片段。

3 單鏈抗體的應(yīng)用

3.1 單鏈抗體在腫瘤治療方面的應(yīng)用

3.1.1 靶向治療

單鏈抗體在腫瘤靶向治療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。比如對(duì)一些急性白血病的治療，單鏈抗體的靶向治療就發(fā)揮了重要作用。N.Kanagawa等成功構(gòu)建了可特異性結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR2/flk1)的ScFv－CTL，可用于腫瘤細(xì)胞的定向治療。近年來(lái)，對(duì)于單鏈抗體在腫瘤靶向治療方面的研究，主要有單鏈抗體融合蛋白、靶向性病毒載體及靶向脂質(zhì)體等。德國(guó)學(xué)者Eckerd等研制出一種雙特異性單鏈體，能夠通過(guò)避免使表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和Met相結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表3 不同表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)表達(dá)及翻譯后修飾情況的比較[7]

3.1.2 腫瘤診斷

與傳統(tǒng)抗體相比，單鏈抗體具有分子量小、穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以快速、高效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部[22]，也因其特異性良好能夠避免非特異性損傷，所以在腫瘤診斷、影像分析與治療方面經(jīng)常使用。比如首先將針對(duì)腫瘤特異性抗原的單鏈抗體進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記，然后將其注入體內(nèi)，以找到腫瘤的相關(guān)位置（定位），然后對(duì)其進(jìn)行診斷與分析，最后就可以進(jìn)行放射性免疫治療。[23]比如國(guó)外研究者得到了一種特異性單鏈抗體(DUP21)，有助于前列腺癌的診斷。段紅等發(fā)現(xiàn)的一種免疫脂質(zhì)體(脂質(zhì)阿霉素)，對(duì)裸鼠鼻咽癌有明顯的抑制作用。

3.1.3 腫瘤治療的其他應(yīng)用

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Anti-CHMP5單鏈可變區(qū)逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠感染細(xì)胞并使其進(jìn)行程序性死亡，[24]如此，就可以使AML白血病細(xì)胞死亡，從而達(dá)到治療目的。雙特異性抗體屬于單鏈抗體的一種，對(duì)腫瘤治療意義重大，可對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和消滅。2014年，Patel等研制出的雙特異性單鏈抗體，利用這種抗體可以消滅腺病毒。[25]此外，還有相關(guān)研究表明可利用ELISA和免疫印跡技術(shù)直接檢測(cè)抗原。

3.2 單鏈抗體在感染性疾病領(lǐng)域的診斷與治療

在我們的日常生活中，經(jīng)常遭受著各種感染性疾病的迫害，其中對(duì)于有些疾病可通過(guò)注射疫苗和抗生素來(lái)進(jìn)行預(yù)防和治療，比如流感病毒等，但對(duì)于一些目前還沒(méi)有可能得到徹底治療的藥物的疾病，比如嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)、艾滋病(AIDS)等，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)還有賴于相關(guān)抗體的治療。

3.2.1 在抗病毒方面的應(yīng)用

單鏈抗體之所以能抑制機(jī)體內(nèi)的病毒，是因?yàn)樗稍诓《舅拗骷?xì)胞內(nèi)表達(dá)并特異性識(shí)別病毒的功能性蛋白質(zhì)。因此，單鏈抗體在抗?jié)h坦病毒、HCM及HBV等方面應(yīng)用廣泛且功用顯著。目前發(fā)現(xiàn)人源化抗體Palivizumab(已獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局FDA的準(zhǔn)許)可用于因呼吸道合胞病毒(RSV)而引起的小兒肺炎，且臨床效果很好，顯著降低了其發(fā)病率。[26]相關(guān)學(xué)者還發(fā)現(xiàn)單鏈抗體可用于抗乙肝病毒。[27]我國(guó)利用近年來(lái)炙手可熱的基因工程抗體技術(shù)，在世界上首先建立了基因工程SARS抗體庫(kù)，使SARS的預(yù)防、診斷和治療更加完善。[28]此外，王慶等[29]創(chuàng)建了單鏈抗體基因文庫(kù)，獲得了針對(duì)呼腸弧病毒VP4的單鏈抗體。吳健敏[30]等人找到了快速檢測(cè)出CSFV病原的方法，為以后檢測(cè)其他類似抗原提供了有效方案。

3.2.2 在抗細(xì)菌方面的應(yīng)用

我國(guó)相關(guān)研究者利用單鏈抗體在植物、動(dòng)物抗細(xì)菌等方面的研究成績(jī)斐然。比如李蒙等通過(guò)對(duì)柑橘潰瘍病的相關(guān)研究，為制備病害治療性抗體提供了可靠保障。[31]武曉麗等構(gòu)建了一種單鏈抗體，可用于抗腸炎沙門菌。[32]

3.2.3 在抗寄生蟲方面的應(yīng)用

可應(yīng)用于免疫學(xué)診斷方面并且其療效與動(dòng)物源性抗體不相上下。White等建立了抗血矛線蟲噬菌體抗體庫(kù)。Yoshida等成功制備了抗瘧原蟲雙特異性單鏈抗體。單鏈抗體作為基因工程抗體的一種，具有人源化和可批量生產(chǎn)等明顯優(yōu)勢(shì)，因此目前相關(guān)研究者普遍將其應(yīng)用到瘧疾的診斷和治療方面，[33]比如汪世平等構(gòu)建了日本血吸蟲未成熟卵的單鏈抗體基因庫(kù)。[34]此外，雙特異性單鏈抗體可用于寄生蟲病的靶向治療。

3.3 自身免疫疾病研究

自身免疫疾病的出現(xiàn)是因?yàn)闄C(jī)體自身產(chǎn)生的一部分抗體發(fā)生病變，導(dǎo)致其親和力異常增高，使機(jī)體免疫系統(tǒng)功能降低，產(chǎn)生病變。比如風(fēng)濕、艾滋病等是典型的自身免疫疾病。而單鏈抗體在艾滋病方面應(yīng)用頻繁，目前已成功制備出的單鏈抗體ScAb2219，可有效抑制HIV病毒的早、晚期感染，有望成為艾滋病基因治療的主要手段。[35]b12-scFV作為HIV-1疫苗的可溶性單鏈抗體，對(duì)于它的研究意義重大，比如Yang和Wang發(fā)現(xiàn)了艾滋病被動(dòng)免疫防治方法，為b12-scFV的制備提供了方便。[36]劉秀俠等使距離更高效HIV-1疫苗的研制成功更進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)了b12-scFV的合成及其在大腸桿菌中表達(dá)的方法。[37]

3.4 單鏈抗體在食品安全方面的應(yīng)用

3.4.1 毒素檢測(cè)

食品中常見(jiàn)的毒素有黃曲霉菌、莫能菌素以及沙門桿菌等。研究發(fā)現(xiàn)，利用單鏈抗體的特異性識(shí)別功能，可以檢測(cè)出食品中的黃曲霉菌，這種方法既高效又成本又低，十分可行。[38]此外，Makvan?di-Nejad等成功制備出了抗莫能菌素單鏈抗體，可檢測(cè)出食物中的莫能菌素；[39]T.Meyer等構(gòu)建的抗沙門桿菌單鏈抗體，能檢測(cè)出食物中是否存在沙門桿菌感染。[40]

3.4.2 農(nóng)、獸藥殘留檢測(cè)

由于農(nóng)藥等一些防蟲、殺蟲試劑的廣泛使用，現(xiàn)在的農(nóng)產(chǎn)品中有藥物殘留的現(xiàn)象已十分普遍，并且大多數(shù)的藥物殘留不溶于水，所以對(duì)農(nóng)、獸藥殘留的檢測(cè)已必不可少。同樣，單鏈抗體在這方面也發(fā)揮了重要作用，比如，廣譜性抗體可更快速有效地檢測(cè)分析出農(nóng)、獸藥殘留；[41]寇立泉等構(gòu)建出了有機(jī)磷抗體庫(kù)，從而使食品中的有機(jī)磷可被高效檢測(cè)出。

3.4.3 食品中重金屬污染檢測(cè)

傳統(tǒng)、常用的檢測(cè)方法有比色法、試紙法、酶學(xué)法、電化學(xué)法、原子吸收法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體法等，但這些方法優(yōu)、缺點(diǎn)并存。[42]對(duì)此，科學(xué)家們利用單鏈抗體又研究出了一些新技術(shù)，比如功能核酸中的核酸適體法，通過(guò)利用重金屬與核酸適體特殊反應(yīng)的產(chǎn)物可檢測(cè)出光、電學(xué)信號(hào)，從而分析樣品進(jìn)行檢測(cè)食品中是否含有重金屬。核酸適體的本質(zhì)是單鏈抗體，但又具有普通抗體所沒(méi)有的一些特性：可在體外篩選、靶分子范圍廣、穩(wěn)定性好、具有可逆性、可進(jìn)行酶擴(kuò)增、剪切等。[43]

4 展 望

相較于一些細(xì)胞工程抗體，單鏈抗體確實(shí)存在許多優(yōu)點(diǎn)而使得其被廣泛運(yùn)用。但是，至今仍有需要改進(jìn)或進(jìn)一步研究的地方，例如：穩(wěn)定性不是很好，有時(shí)會(huì)形成聚合物，不利于長(zhǎng)期使用；雖然雙特異性抗體目前已經(jīng)有所發(fā)展，但是不易制備，造成其實(shí)際應(yīng)用不多；盡管目前已經(jīng)對(duì)因使用免疫毒素而帶來(lái)的一些副作用進(jìn)行了防護(hù)，但是不夠徹底仍然存在一些問(wèn)題，比如出現(xiàn)血管滲漏綜合征就是因?yàn)槊庖叨舅氐氖褂枚鸬摹44]單鏈抗體的不足之處遠(yuǎn)不止這些，但是通過(guò)以上幾方面的介紹，我們可以很明顯地得出一個(gè)結(jié)論：?jiǎn)捂溈贵w還有待更深層次的研究，從而取其長(zhǎng)補(bǔ)其短，以便更好地造福人類。