中性蛋白酶催化水解藍(lán)圓鲹提取粗魚油的工藝條件優(yōu)化

黃茂坤，汪 泳

藍(lán)圓鲹為暖水性中上層魚，廣泛分布在我國(guó)福建省沿岸、海南省東部近海岸等地［1］；其繁殖周期短、生長(zhǎng)快、產(chǎn)量大，全國(guó)捕撈量可達(dá)60多萬噸，是我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)魚類之一［2］.據(jù)相關(guān)研究報(bào)道［3-5］，藍(lán)圓鲹富含多種人體必須氨基酸和不飽和脂肪酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是優(yōu)質(zhì)的海洋魚類資源.但是，藍(lán)圓鲹肉質(zhì)松軟、肉色暗，離水后極易腐敗變質(zhì)，且捕撈時(shí)段又集中在夏季，大量漁獲物短期內(nèi)集中上市［6］，因此極少鮮售，多數(shù)加工為咸干制品或飼料，總體加工水平低下，造成資源浪費(fèi).近年來，海洋魚油類產(chǎn)品中因含有多種具有優(yōu)良生理活性的不飽和脂肪酸而深受消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)需求量越來越大，且該類產(chǎn)品附加值高，可作為實(shí)現(xiàn)低值海魚藍(lán)圓鲹高值化加工利用的有效途徑之一.海洋魚油的加工方法有堿提取、蒸煮提取、蛋白酶酶水解提取、超臨界萃取等，其中堿提取、蒸煮提取等傳統(tǒng)方法存在魚油分離效果低、溶劑殘留造成環(huán)境污染等問題［6-7］.超臨界萃取法成本太高，不適合大規(guī)模生產(chǎn).而蛋白酶水解法主要是利用蛋白酶破壞蛋白質(zhì)與脂肪的結(jié)合關(guān)系［8］，該方法魚油分離效果好，無環(huán)境污染問題，副產(chǎn)物還可進(jìn)一步開發(fā)氨基酸類產(chǎn)品，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，是當(dāng)前比較實(shí)用的魚油提取方法.

為此，本試驗(yàn)選用中性蛋白酶作為提取藍(lán)圓鲹粗魚油水解用酶，并對(duì)其水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為藍(lán)圓鲹魚油的開發(fā)提取提供初步技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮藍(lán)圓鲹（購(gòu)于泉州市豐澤區(qū)仁風(fēng)菜市場(chǎng)）；中性蛋白酶（食品級(jí)，江蘇銳陽生物科技有限公司）；氫氧化鈉（AR，西隴化工股份有限公司）；鹽酸（AR，西隴化工工廠有限公司）；石油醚（AR，沸程30～60℃，西隴化工股份有限公司）；無水乙醇（AR，西隴化工股份有限公司）.

1.2 儀器與設(shè)備

AL104-IC型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LXP-10型鋁合金絞肉機(jī)，永康市益海順工貿(mào)有限公司；L18-Y920型九陽破壁料理機(jī)，九陽股份有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；PHS-3C型精密PH計(jì)，上海精科有限公司；SHB-Ⅲ磁力攪拌水浴鍋，金壇市良友儀器有限公司.

1.3 試驗(yàn)方案

（1）工藝流程.新鮮藍(lán)圓鲹除去內(nèi)臟，清洗、瀝干后凍藏保存→解凍→用絞肉機(jī)將魚絞碎得藍(lán)圓鲹樣品→加藍(lán)圓鲹樣品等質(zhì)量的蒸餾水，與樣品一起放入料理機(jī)勻漿→稱取30g勻漿后的藍(lán)圓鲹魚糜于250ml燒杯中，調(diào)節(jié)料液比→調(diào)節(jié)pH值→加入中性蛋白酶→置于磁力攪拌水浴鍋恒溫酶解→95℃水浴加熱處理10min，使中性蛋白酶失活→將酶水解物轉(zhuǎn)移至離心機(jī)離心處理（轉(zhuǎn)速7000r/min）10min→取出漂浮于離心液最上層的油狀物，用石油醚進(jìn)行萃取→將溶有油狀物的石油醚置于60℃的水浴中，將石油醚蒸干→再置于真空干燥箱中干燥至恒重→粗魚油.

（2）單因素試驗(yàn)方案.本試驗(yàn)以藍(lán)圓鲹粗魚油得率為指標(biāo)，考察酶水解時(shí)間、酶水解反應(yīng)體系初始PH值、酶水解溫度、酶添加量、酶水解反應(yīng)體系料液比5個(gè)工藝因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，每次進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，結(jié)果取三組平行試驗(yàn)所測(cè)指標(biāo)值的平均值，具體方案設(shè)計(jì)如下：

①酶水解時(shí)間的單因素試驗(yàn)方案：固定中性蛋白酶添加量為1%，料液比為1∶3，水解溫度為50℃，酶水解反應(yīng)體系初始pH值為7.0，分別考察中性蛋白酶水解時(shí)間為1h、2h、3h、4h、5h、6h對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響，選擇出試驗(yàn)結(jié)果較好的酶水解時(shí)間.

②酶水解反應(yīng)體系初始pH值的單因素試驗(yàn)方案：固定中性蛋白酶添加量為1%，料液比為1：3，水解溫度為50℃，酶水解時(shí)間為4h，分別考察酶水解反應(yīng)體系初始pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響，選擇出試驗(yàn)結(jié)果較好的酶水解反應(yīng)體系初始pH值.

③酶水解溫度單因素試驗(yàn)方案：固定中性蛋白酶添加量為1%，料液比為1∶3，酶水解時(shí)間為4h，酶水解反應(yīng)體系初始pH值為7.0，分別考察酶水解溫度為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響，選擇出試驗(yàn)結(jié)果較好的酶水解溫度.

④酶添加量的單因素試驗(yàn)方案：固定酶水解反應(yīng)體系料液比為1∶3，酶水解時(shí)間為4h，酶水解反應(yīng)體系初始pH值為7.0，酶水解溫度為50℃，分別考察中性蛋白酶添加量為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響，選擇出試驗(yàn)結(jié)果較好的酶添加量.

⑤酶水解反應(yīng)體系料液比單因素試驗(yàn)方案：固定酶水解時(shí)間為4h，酶水解反應(yīng)體系初始pH值為7.0，酶水解溫度為50℃，酶添加量為2%，分別考察酶水解反應(yīng)體系料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響，選擇出試驗(yàn)結(jié)果較好的酶水解反應(yīng)體系料液比.

（3）正交試驗(yàn)方案.為進(jìn)一步確定藍(lán)圓鲹粗魚油提取的最佳工藝條件，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定酶水解反應(yīng)體系料液比為1∶3，選擇酶水解時(shí)間（A）、酶水解反應(yīng)體系初始pH值（B）、酶水解溫度（C）、酶添加量（D）作為試驗(yàn)因子，以藍(lán)圓鲹粗魚油得率為指標(biāo)，采用L1（645）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1，優(yōu)化中性蛋白酶水解藍(lán)圓鲹提取粗魚油的工藝條件.

表1 L16（45）正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 指標(biāo)測(cè)定

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

（1）酶水解時(shí)間對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響.以酶水解時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，藍(lán)圓鲹粗魚油得率為縱坐標(biāo)，繪制酶水解時(shí)間與藍(lán)圓鲹粗魚油得率的關(guān)系曲線，結(jié)果如圖1所示.根據(jù)圖1可知，中性蛋白酶作用時(shí)間在4h內(nèi)時(shí)，藍(lán)圓鲹粗魚油得率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)作用時(shí)間超過4h后，藍(lán)圓鲹粗魚油得率略微下降，且變化趨于穩(wěn)定，這可能是因?yàn)椋磻?yīng)初期中性蛋白酶與反應(yīng)底物藍(lán)圓鲹充分接觸，有效地催化藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)，破壞了藍(lán)圓鲹樣品中脂肪與蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用，使脂肪分離出來，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水解產(chǎn)物不斷增加，甚至導(dǎo)致水解逆反應(yīng)的發(fā)生，直至整個(gè)水解反應(yīng)趨于平衡，因此，藍(lán)圓鲹粗魚油得率的變化在反應(yīng)時(shí)間超過4h后會(huì)適當(dāng)回落，并最終趨于穩(wěn)定.另外，水解時(shí)間太長(zhǎng)，粗魚油中的不飽和脂肪酸等成分容易氧化導(dǎo)致所得粗魚油顏色變深，因此，綜合考慮，選擇酶解時(shí)間4h為后續(xù)試驗(yàn)的參考工藝條件.

圖1 酶水解時(shí)間對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響

（2）酶水解反應(yīng)體系初始pH值對(duì)粗魚油得率的影響.以藍(lán)圓鲹水解反應(yīng)體系的初始pH值為橫坐標(biāo)，藍(lán)圓鲹粗魚油得率為縱坐標(biāo)，繪制酶水解反應(yīng)體系初始pH值與藍(lán)圓鲹粗魚油得率的關(guān)系曲線，結(jié)果如圖2所示.根據(jù)圖2可知，當(dāng)水解反應(yīng)體系的初始pH值為4.0～7.0時(shí)，藍(lán)圓鲹粗魚油得率隨著水解反應(yīng)體系初始pH值的增加而增加，而水解反應(yīng)體系初始pH值超過7.0后，粗魚油得率開始有所下降.這是因?yàn)?，中性蛋白酶有最適催化水解反應(yīng)pH條件要求，當(dāng)反應(yīng)體系初始pH條件不一樣時(shí)，中性蛋白酶在反應(yīng)體系中表現(xiàn)出對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)的催化水解活性不一樣，對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)與脂肪結(jié)合結(jié)構(gòu)的破壞程度不一樣，最終藍(lán)圓鲹粗魚油得率也會(huì)不一樣.因此，將酶水解反應(yīng)體系初始pH值設(shè)為7.0，作為后續(xù)試驗(yàn)的參考工藝條件.

圖2 初始pH值對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響

（3）酶水解溫度對(duì)粗魚油得率的影響.以酶水解溫度為橫坐標(biāo)，藍(lán)圓鲹粗魚油得率為縱坐標(biāo)，繪制酶水解溫度與藍(lán)圓鲹粗魚油得率的關(guān)系曲線，結(jié)果如圖3所示.根據(jù)圖3可知，藍(lán)圓鲹粗魚油得率隨著水解反應(yīng)設(shè)置溫度的提高呈先上升后下降的趨勢(shì)，最佳的試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)在50℃附近.這是因?yàn)?，中性蛋白酶有一個(gè)最適的催化水解反應(yīng)溫度，當(dāng)其所處水解反應(yīng)體系的溫度低于其最適催化水解反應(yīng)溫度時(shí)，隨著反應(yīng)體系溫度的提高，其對(duì)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)的水解作用逐漸增強(qiáng)，有利于破壞藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)與脂肪的結(jié)合，使脂肪游離出來，提高粗魚油的得率，相反，當(dāng)反應(yīng)體系溫度超過其最適反應(yīng)溫度后，繼續(xù)升高溫度反而會(huì)使其催化活性降低甚至失活，從而影響試驗(yàn)結(jié)果.

圖3 酶水解溫度對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響

（4）酶添加量對(duì)粗魚油得率的影響.以中性蛋白酶添加量為橫坐標(biāo)，藍(lán)圓鲹粗魚油得率為縱坐標(biāo)，繪制酶添加量與藍(lán)圓鲹粗魚油得率的關(guān)系曲圖，結(jié)果如圖4所示.根據(jù)圖4可知，隨著中性蛋白酶添加量的增加，藍(lán)圓鲹粗魚得率呈逐漸增加的趨勢(shì)，直至中性蛋白酶添加量超過2%以后，藍(lán)圓鲹粗魚油得率開始略有下降.這可能是因?yàn)橹行缘鞍酌冈诎l(fā)揮催化水解作用時(shí)與反應(yīng)底物有固定的接觸位點(diǎn)，其催化水解反應(yīng)達(dá)到最佳效果所需的用量是相對(duì)固定的，在低于最佳用量的情況下，提高其添加量，能有效促進(jìn)藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)的分解，破壞蛋白質(zhì)與脂肪的結(jié)合結(jié)構(gòu)，提高粗魚油的得率，但超過其最佳用量，反而可能會(huì)因?yàn)槠渥陨淼鞍踪|(zhì)屬性而發(fā)生自溶，從而影響反應(yīng)的進(jìn)行.

圖4 酶添加量對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響

（5）酶水解反應(yīng)體系料液比對(duì)粗魚油得率的影響.以酶水解反應(yīng)體系反應(yīng)體系料液比為橫坐標(biāo)，藍(lán)圓鲹粗魚油得率為縱坐標(biāo)，繪制料液比與藍(lán)圓鲹粗魚油得率之間的關(guān)系曲線，如圖5所示.根據(jù)圖5可知，隨著料液比的減小，藍(lán)圓鲹粗魚油得率呈先提高后降低的變化趨勢(shì).這是因?yàn)?，料液比的變化?huì)影響藍(lán)圓鲹原料和中性蛋白酶在反應(yīng)體系中的分散情況，料液比過高時(shí)，藍(lán)圓鲹原料在反應(yīng)體系無法充分分散，不能與中性蛋白酶很好地接觸，會(huì)影響催化水解反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致粗魚油得率不高；而料液比太低時(shí)，又可能導(dǎo)致中性蛋白酶在反應(yīng)體系中過于分散，減少其與分散在反應(yīng)體系中藍(lán)圓鲹原料的接觸機(jī)會(huì)，一樣會(huì)降低粗魚油得率.

圖5 料液比對(duì)藍(lán)圓鲹粗魚油得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，試驗(yàn)結(jié)果的極差和方差分析結(jié)果分別見表3和表4.根據(jù)表3可知，影響中性蛋白酶催化水解藍(lán)圓鲹提取粗魚油的4個(gè)工藝因素極大值組合為A2B2C2D3，即最優(yōu)工藝條件為：酶水解時(shí)間4h、酶水解反應(yīng)體系初始pH值7.0、酶水解溫度50℃、酶添加量2.3%.根據(jù)表4可知，因素D（酶添加量）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著，因素A（酶水解時(shí)間）、B（酶水解反應(yīng)體系初始pH值）、C（酶水解溫度）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小為：D（酶添加量）＞A（酶水解時(shí)間）＞C酶水解溫度）＞B（酶水解反應(yīng)體系初始pH值）.在酶水解反應(yīng)體系料液比為1∶3的條件下，采用上述最優(yōu)工藝條件組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得藍(lán)圓鲹粗魚油得率為3.41%.水解處理藍(lán)圓鲹蛋白質(zhì)制備粗魚油是藍(lán)圓鲹魚油開發(fā)的正確方向，在后續(xù)研究中可繼續(xù)探索其他蛋白酶在藍(lán)圓鲹魚油開發(fā)中的應(yīng)用情況，研究出更佳的制備工藝方案，并對(duì)制備的粗魚油進(jìn)行精制處理，開發(fā)出相應(yīng)產(chǎn)品，為低值海魚藍(lán)圓鲹的高值化利用提供了技術(shù)參考.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 極差分析結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用中性蛋白酶酶水解反應(yīng)體系料液比1∶3、酶水解時(shí)間4h、酶添加量2.3%、酶水解溫度50℃、酶水解反應(yīng)初始pH值7.0的工藝條件水解藍(lán)圓鲹制備粗魚油的得率為3.41%，與謝燕等［9］測(cè)得藍(lán)圓鲹各部位粗脂肪含量為2.1%～3.8%的結(jié)果基本吻合，說明采用中性蛋白酶水解法能夠較高效地從藍(lán)圓鲹提取出粗魚油.另外，借鑒白鑫華［10］、衣美艷［11］、駱婷［12］等的研究經(jīng)驗(yàn)，相較于目前市面上常用的堿水解提取魚油的方法，蛋白酶水解法不會(huì)產(chǎn)生諸如對(duì)環(huán)境造成污染的堿廢棄液等問題，而且蛋白酶解反應(yīng)條件溫和，具有高度的專一性，只通過高效降解原料中的蛋白質(zhì)分子，釋放出包埋于其中的油脂，對(duì)其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)幾乎無任何破壞作用，特別適用于海洋魚油的開發(fā)利用.因此，本試驗(yàn)采用中性蛋白酶催化