牛奶制品與植物蛋白制品中主要蛋白質組成的比較分析

俞海東，韓榮勛，羅靜波

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州434025)

植物蛋白制品一般是由大豆蛋白或乳清蛋白等幾種蛋白混合而成的高純度蛋白質粉劑，而牛奶制品是收集正常飼養(yǎng)的健康奶牛乳房分泌的原乳后再經過一系列加工后得到的一種富含蛋白質的產品。蛋白質約占人體重量的17%～20%，是組成人體細胞組織的重要成分，也是生命活動的主要執(zhí)行者。牛奶蛋白質的生物價為85，而小麥、大豆、玉米和小米蛋白質的生物價分別為67、64、60和57[1]。因此生物價較高的牛奶可以作為燒傷、感染、做過外科大手術、神經性厭食、消化不良、小腸吸收障礙等患者以及孕婦、乳母、進食少的老年人和專業(yè)健身人群及運動員的優(yōu)良蛋白質來源[2]。隨著近年來生活水平的提高，人們對高蛋白食物的需求也越來越高，植物蛋白制品和牛奶制品越來越得到人們的青睞，其市場也日益火爆。然而為了降低成本，生產者往往會加入大豆蛋白等異源蛋白，這會影響牛奶蛋白質的組成比例和人體對牛奶蛋白質的消化吸收[3]。到目前為止已有許多關于牛奶或牛奶制品中摻入三聚氰胺、尿素或植物蛋白等物質的相關報道。這些研究主要采用HPCE[4]、LC-MS/MS[5]、分子印跡聚合物法[6]、熒光光譜法[7]、酶聯(lián)免疫檢測方法[8]、GC-MS/MS[9]等技術來檢測是否混有三聚氰胺，或采用同位素稀釋質譜法、HPLC和分級消解法[10]等方法檢測是否混有尿素。關于牛奶制品中是否加入植物蛋白等的研究相對較少，主要涉及采用LC-MS及分子檢測法進行定性檢測[11]，而采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法快速檢測的相關報道比較少。

本研究采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法分析植物蛋白制品、巴氏消毒牛奶、奶粉及酸奶的主要蛋白質組成，觀察植物蛋白制品和不同牛奶制品中蛋白質組成的差異，從而為實驗室檢測牛奶制品中是否加入植物蛋白及衡量乳制品的產品品質提供參考依據，也為人們從植物蛋白制品和牛奶制品中選擇更容易消化吸收的產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和準備

實驗樣品為從市場購買的植物蛋白制品、巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶。植物蛋白制品和牛奶奶粉均按照各自說明書分別配置成植物蛋白制品混懸液和奶粉溶液，巴氏消毒牛奶在4℃、12000r/min條件下離心20min除去乳脂和雜質。將100μL植物蛋白制品混懸液、奶粉溶液、巴氏消毒牛奶以及酸奶樣品分別與等體積的裂解緩沖液(0.3% SDS、3% DTT、蛋白酶抑制劑和0.5mol/L Tris/HCl，pH8.0)充分混合后在低溫條件下對樣品進行超聲波粉碎處理。在室溫條件下反應1h后，在4℃、12000r/min條件下離心20min去除沉淀物。取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作為標準溶液，采用Bradford法測定蛋白濃度后分裝成每管60μg樣品并保存于-70℃冰箱中。

1.2 SDS-PAGE分析法

本研究中SDS-PAGE分別采用8%和15%的分離膠[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40% Acry/Bis(29∶1)、蒸餾水、10% SDS、10% APS、TEMED]，并采用同等蛋白質含量的上樣方法，上樣順序為Marker、60μg植物蛋白制品蛋白、60μg巴氏消毒牛奶蛋白，Marker、60μg植物蛋白制品蛋白、60μg奶粉蛋白，Marker、60μg植物蛋白制品蛋白、60μg酸奶蛋白。在100V電壓條件下進行分離，實驗所用Marker電泳后出現(xiàn)6條條帶，相對分子質量分別為200、150、100、80、60、40ku。

電泳結束后取出凝膠，經超純水漂洗后將凝膠放入固定液[30%(體積比)甲醇、10%(體積比)醋酸]中固定，1h后取出凝膠放入考馬斯亮藍R-250染色液中染色24h。染色結束后用脫色液(1%醋酸)脫色后進行圖像采集。

2 結果與分析

對相同蛋白質質量的植物蛋白制品、巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶，在相同電泳條件下，采用8%、15%的分離膠進行SDS-PAGE凝膠電泳，所得的電泳圖譜見圖1～圖6。

將所得蛋白質電脈圖譜進行比對分析可得出，在8%的分離膠中觀察到植物蛋白制品蛋白在100～40ku區(qū)域內存在5條明顯的蛋白質條帶；而在巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶蛋白在40ku以下存在2條條帶，分別為αs-酪蛋白條帶以及還未分離的β-酪蛋白、κ-酪蛋白和乳球蛋白的混合條帶。在15%的分離膠中觀察到植物蛋白制品蛋白在80ku以下區(qū)域存在7條明顯的蛋白質條帶，而巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶蛋白在40ku以上不存在蛋白質條帶；在40ku以下存在5條條帶，分別為αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳球蛋白條帶?？傮w來說，植物蛋白制品相對于牛奶含有更多的高分子量蛋白質，例如在100～40ku區(qū)域內存在4條條帶；而牛奶中主要含有小分子量蛋白質，例如在小于30ku的區(qū)域內存在4條條帶。

圖1 用8%分離膠分離所得植物蛋白制品及巴氏消毒牛奶蛋白質的SDS-PAGE電泳圖譜 圖2 用15%的分離膠分離所得植物蛋白制品及巴氏消毒牛奶蛋白質的SDS-PAGE電泳圖譜

圖3 用8%分離膠分離所得植物蛋白制品及牛奶奶粉蛋白質的SDS-PAGE電泳圖譜 圖4 用15%的分離膠分離所得植物蛋白制品及牛奶奶粉蛋白質的SDS-PAGE電泳圖譜

圖5 用8%分離膠分離所得植物蛋白制品及酸奶蛋白質的SDS-PAGE電泳圖譜 圖6 用15%的分離膠分離所得植物蛋白制品及酸奶蛋白質的SDS-PAGE電泳圖譜

3 討論與結論

為了探討植物蛋白制品和牛奶制品的蛋白質組成差異，本研究采用SDS-PAGE法比較分析了植物蛋白制品、巴氏消毒牛奶、奶粉和酸奶等奶制品的主要蛋白質組成。結果表明，植物蛋白制品與牛奶制品的蛋白質組成之間表現(xiàn)出顯著差異。在8%分離膠凝膠電泳圖譜中能觀察到植物蛋白制品有5條蛋白質條帶，而牛奶制品中的蛋白質條帶只有2條；在15%分離膠凝膠電泳圖譜中能觀察到植物蛋白制品有7條蛋白質條帶，而巴氏消毒牛奶和牛奶奶粉中只能在40ku以下區(qū)域內觀察到5條蛋白質條帶，酸奶只能觀察到4條蛋白質條帶。在15%分離膠中，相同的電壓和分離時間下，酸奶相對于巴氏消毒牛奶和牛奶奶粉少了1條酪蛋白條帶。這可能與酸奶經過乳酸菌發(fā)酵有關，在發(fā)酵過程中，乳酸菌將乳蛋白分解，所以在15%分離膠中只能觀察到4條蛋白質條帶。

本研究數據可為鑒別牛奶制品當中是否加入植物蛋白提供參考。已報道的有關鑒別奶粉中是否摻入植物蛋白的研究中，宋宏新等[11]采用SDS-PAGE法比較分析了脫脂乳中摻入一定比例的大豆蛋白粉和乳清蛋白粉，發(fā)現(xiàn)該方法的最低檢出限分別為0.79%和4.4%(質量比)，并且得到了與本研究中巴氏消毒牛奶和牛奶奶粉結果類似的脫脂乳SDS-PAGE圖譜，2個實驗結果類似的原因可能是因為使用的都是牛奶和牛奶制品以及相似的方法，但是本研究所涉及的酸奶是經過乳酸菌發(fā)酵而成的牛奶制品，所以酸奶的圖譜與他們的圖譜有所差異。

本研究采用的是比較簡便的SDS-PAGE法，并且未除去牛奶中的高豐度蛋白——酪蛋白，所以只能觀察到牛奶中占主要成分的酪蛋白和乳球蛋白的條帶，而無法觀察到牛奶中低豐度蛋白——乳清蛋白的條帶。這一結果可以應用到牛奶及與牛奶相關的奶制品中是否加入乳清蛋白的鑒定上。如果在蛋白質圖譜中能明顯地觀察到酪蛋白和乳球蛋白條帶以外的蛋白質條帶的話，就可以懷疑是否加入如植物蛋白制品或乳清蛋白粉等其他蛋白質類物質。到目前為止，有關巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶等牛奶制品蛋白與植物蛋白制品蛋白比較的研究鮮有報道。本研究揭示了巴氏消毒牛奶、牛奶奶粉和酸奶等牛奶制品蛋白與植物蛋白制品蛋白在組成上的差異。本結果對于實驗室檢測牛奶制品中是否含有植物蛋白提供了參考依據，也可為消費者從各種奶制品和植物蛋白制品中選擇更容易消化吸收的產品提供參考。