高效液相色譜法檢測飼料添加劑樣品中的辣椒素類似物

陳玉艷，于家豐

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

辣椒是生活中常見的食品、香辛料和調(diào)味品。辣椒素又稱辣椒堿，是辣椒的活性成分，是辣椒的次級代謝產(chǎn)物，對哺乳動物包括人類都有刺激性并可在口腔中產(chǎn)生灼燒感，不僅可作為食品添加劑，在醫(yī)藥保健、海洋防污及電線電纜的防蟻防鼠等方面同樣具有著廣闊的應(yīng)用。從辣椒中提取分離出的辣椒堿作為食品加工過程中的添加劑，有利于辣度的控制和辣椒堿的充分吸收利用。另外，現(xiàn)代研究表明，辣椒堿具有消炎、鎮(zhèn)痛、麻醉和戒毒等方面的功效，還可抑制腫瘤的發(fā)生，對皮膚病和減肥擁有特殊功效[1-3]。辣椒素作為驅(qū)避劑，因其強烈辛辣味具有較強驅(qū)趕作用，并且不殺死海洋生物，具有明顯的生態(tài)效益。二氫辣椒素具有殺菌消毒的作用，可作為食品防腐劑，還可促進胃腸蠕動及胃液分泌，幫助消化。

辣椒素類物質(zhì)是一種混合物，目前己經(jīng)確定有19種成分，其中辣椒素、二氫辣椒素等5種組分的含量最高，之和已占總量99%左右，5種化合物中又以辣椒素（占總量69%）、二氫辣椒素（占總量22%）含量高，二者之和占總量91%，降二氫辣椒素占到7%[4]。

對辣椒素類似物檢測方法有多種，包括化學分析方法和儀器分析方法，前者有凱氏定氮法[5]，后者有紫外可見光光度法[6]、三維熒光光譜法[7]、高效液相色譜法。高效液相色譜法適用于復(fù)雜成分混合物的分離、定性與定量，效果較好，根據(jù)辣椒素類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點和光吸收特性，一般采用反相化學鍵合相，紫外檢測器檢測。該方法是目前國內(nèi)外食品或蔬菜行業(yè)在辣椒素類物質(zhì)測定研究中使用較多的方法。它具有快速、靈敏、準確度高、操作簡單的優(yōu)點，能同時分離、測定辣椒素類物質(zhì)的主要辣味成分，但在飼料添加劑領(lǐng)域的相關(guān)檢測方法研究未見報道。

食品中辣椒素的測定方法提取液選的是甲醇-四氫呋喃溶液[8]，流動相也是甲醇-水溶液[9-11]，甲醇、四氫呋喃試劑提取試劑較貴，甲醇對檢測人員存在危害。本研究發(fā)現(xiàn)乙醇提取、乙腈-水流動相分離效果良好，適用于基質(zhì)復(fù)雜的飼料添加劑中辣椒素類似物的檢測，實際應(yīng)用中更為適合。

1 材料與方法

1.1 試劑和溶液乙醇：色譜純。國藥集團化學試劑有限公司；乙腈：色譜純。Fisher公司；試驗用水；辣椒素標準品：含量99%；二氫辣椒素標準品：含量99%；降二氫辣椒素標準品：含量99%。

1.2 儀器設(shè)備Waters高效液相色譜儀2695：配雙通道2998紫外檢測器，美國Waters公司；Waters C8色譜柱：粒度5 μm，長度150㎜，內(nèi)徑3.9㎜，美國Waters公司；AT200分析天平；回流冷凝器；微孔濾膜：0.45 μm。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：C8柱（5 μm，150 mm×3.9 mm）；流動相：乙腈-水（40:60）；流速：1.00 mL/min；檢測波長：280 nm，色譜掃描范圍210～400 nm。

1.3.2 標準品的制備標準溶液濃度0.15 mg/mL。準確稱量75 mg辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒素標準品分別至500 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度并混勻。用一次性注射器吸取適量過0.45 μm濾膜于棕色液相小瓶中，上機測定。圖譜結(jié)果如圖1～4。

圖1 辣椒素標準品色譜圖Fig.1Chromatogram of capsaicin

圖2 二氫辣椒素標準品色譜圖Fig.2 Chromatogram of dihydrocapsaicin

圖3 降二氫辣椒素標準品色譜圖Fig.3 Chromatogram of noradihydrocapsaicin

圖4 對照品色譜圖（色譜峰依次是降二氫辣椒素、辣椒素和二氫辣椒素）Fig.4 Chromatogram of noradihydrocapsaicin,capsaicin,dihydrocapsaicin

從圖1～4可以看出，辣椒素的保留時間在10 min左右，降二氫辣椒素的保留時間在9 min左右，二氫辣椒素的保留時間在14 min左右。由此可判斷STD標準對照品圖譜3個色譜峰依次是降二氫辣椒素、辣椒素和二氫辣椒素。

1.3.3 樣品提取 本方法研究的飼料添加劑基質(zhì)有辣椒酊、辣椒粉、氫化棕櫚油、葡萄糖等。準確稱量25 g飼料添加劑樣品樣品加入到500 mL蒸餾燒瓶中，向其中添加200 mL乙醇和少許沸石，按照從上到下、從左到右安裝裝置，燒瓶連接回流冷凝器，60℃下緩慢回流4 h，冷卻。提取液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相小瓶，上機測定。三批次樣品，每批次雙平行處理，結(jié)果見表1。

2 結(jié)果與分析

表1 不同樣品中辣椒素類似物的色譜峰面積Table 1 Chromatographic peak area of capsaicin analogues in different samples

2.1 加標回收試驗按照上述樣品提取、色譜分析條件進行分析，分別取同一飼料添加劑樣品，添加0.94、1.88、3.76 mg/g 3個質(zhì)量濃度的辣椒素標準溶液，進行加標回收試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2 飼料添加劑樣品中的降二氫辣椒素、辣椒素、二氫辣椒素回收率測定結(jié)果Table 2Determination results of recovery rates of no radihydroca psaicin、capsaicin、dihydroca psaicin

由表2可知，降二氫辣椒素、辣椒素、二氫辣椒素的加標回收率分別為91.39%～102.78%、85.91%～101.96%、89.16%～96.86%，說明本方法準確度高，方法有效可行。

2.2 精密度試驗取含量為0.15 mg/mL的3種辣椒素類似物的STD標準對照品溶液進行檢測，進樣10 μL，重復(fù)測試6次，通過對色譜峰面積的比較來反映儀器精密度。測定降二氫辣椒素、辣椒素和二氫辣椒素的RSD分別為0.75%、0.92%和0.38%。表明測試儀器在該色譜條件下有良好的精密度。

2.3 重復(fù)性試驗取同一批次飼料添加劑樣品，按上述方法提取6個平行樣品進行測定。降二氫辣椒素RSD=1.93%，辣椒素RSD=1.18%，二氫辣椒素RSD=1.61%，表明本方法重復(fù)性良好。

3 討論和結(jié)論

本研究建立了飼料添加劑中辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒素的提取技術(shù)和高效液相色譜檢測方法。在此檢測條件下，最后出峰的二氫辣椒素保留時間大概在14.6 min，與辣椒及辣椒制品中辣椒素物質(zhì)測定的相關(guān)方法比較[11-12]，保留時間大概縮短6～11 min，在大批量的樣品分析中能節(jié)省大量的試劑成本和時間成本，且可以規(guī)避甲醇-水流動相黏度大、傷柱子、峰性差等缺點，具有實際應(yīng)用價值。

降二氫辣椒素、辣椒素、二氫辣椒素的加標回收率分別平均為97.52%、93.72%、93.99%，能滿足分析要求，精密度RSD＜1%，顯示儀器精密度良好，測定結(jié)果滿意，重復(fù)性試驗RSD＜2%，再現(xiàn)性結(jié)果滿意。

試驗結(jié)果顯示，樣品中含量最多的是辣椒素，二氫辣椒素次之，降二氫辣椒素最少，與已知理論相符。所建立的分析方法樣品前處理提取試劑及流動相對試驗人員人身健康有幫助，方法簡便快捷，易于操作，高效準確，能夠很好地檢測出復(fù)雜基質(zhì)飼料添加劑樣品中3種辣椒素物質(zhì)的含量，適合批量檢測，值得推廣。在本檢測方法的基礎(chǔ)上，可以進一步研究色譜分離方法，可以考慮梯度洗脫，以便更高通量地檢測更多種辣椒堿類活性物質(zhì)。