SD大鼠肢體缺血-再灌注損傷模型的建立

申 震，朱付平，潘成熙，羅偉業(yè)，周富強(qiáng)，李武平

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007)

缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷是臨床中一種常見的復(fù)雜的病理過程，是指缺血一段時(shí)間后，重新恢復(fù)血流，組織損傷程度反而進(jìn)一步加重，器官功能進(jìn)一步惡化的綜合征[1]。IR主要影響O2依賴性器官，如肝臟、腎臟、心臟、腦、腸道以及骨骼肌等[2]，多見于器官移植術(shù)、冠狀動(dòng)脈成形術(shù)、溶栓治療以及擠壓傷、四肢血管損傷、斷肢再植、骨筋膜間室綜合癥等骨科疾病[3 - 4]。相較于其他器官，骨骼肌研究較少，但骨骼肌對(duì)缺血卻十分敏感[5]，文獻(xiàn)報(bào)道[6]，缺血時(shí)間超過2.5 h血流再通就會(huì)導(dǎo)致肢體缺血-再灌注損傷(limb ischemia-reperfusion injury，LIRI)，尤其是線粒體等重要代謝細(xì)胞器會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的病理改變。近年來，由骨骼肌缺血復(fù)灌導(dǎo)致的LIRI的發(fā)病率、致殘率乃至病死率呈逐年上升的趨勢(shì)，若沒有進(jìn)行及時(shí)有效的治療，對(duì)患者的損害程度極大，嚴(yán)重者引發(fā)遠(yuǎn)隔臟器損傷[7 - 8]，甚至誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征或多器官功能不全綜合征，給患者個(gè)人及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[9]。故而，構(gòu)建LIRI模型并研究LIRI發(fā)病機(jī)制以及防治要點(diǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

然而，當(dāng)前LIRI模型的構(gòu)建方法主要是通用無創(chuàng)血管夾夾閉或無創(chuàng)縫合線結(jié)扎股動(dòng)脈進(jìn)行缺血再灌注操作[10]。這種方式對(duì)動(dòng)物損傷較大，無菌條件要求高，操作精細(xì)復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，且易出現(xiàn)切口感染，誤傷神經(jīng)血管等問題，成功率較低。鑒于以上因素，本研究改良而成一種應(yīng)用于SD大鼠LIRI模型的構(gòu)建方法，并進(jìn)行骨骼肌組織形態(tài)學(xué)等相關(guān)檢測(cè)，以評(píng)價(jià)模型的可靠性，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用15只2月齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(232.50±6.00) g，各組間比較差異無顯著性(P> 0.05)，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK (湘) 2013-0004]，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作在湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[SYXK (湘) 2013-0005]，實(shí)驗(yàn)室溫度20℃～24℃，相對(duì)濕度60%～70%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理相關(guān)規(guī)定，科研項(xiàng)目倫理審查意見號(hào)：HN-LL-GZR-201609，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物處置符合科技部頒行的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，滿足動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利以及倫理原則的相關(guān)要求，嚴(yán)格遵守動(dòng)物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅染色(HE)液(廣州，凱秀貿(mào)易有限公司)；4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI，美國(guó)，Sigma公司)；戊巴比妥鈉(美國(guó)，Sigma公司)。市售統(tǒng)一規(guī)格橡皮圈，尼龍?jiān)鷰В?0 mL注射器；BX51型正置熒光顯微鏡(日本，Olympus公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組，缺血再灌注0 h組、2 h組、4 h組以及8 h組5個(gè)組，每組3只。所有SD大鼠術(shù)前禁食禁飲12 h，3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉。正常組大鼠不阻斷血流，缺血再灌注0 h組、2 h組、4 h組以及8 h組各組大鼠采用50 mL注射器自制成套管及市售統(tǒng)一規(guī)格橡皮圈復(fù)制SD大鼠右后肢缺血-再灌注損傷模型。既要達(dá)到阻斷血流目的，又要避免橡皮圈對(duì)骨骼肌的直接損傷，經(jīng)摸索實(shí)驗(yàn)選取直徑0.8 cm和1.0 cm橡皮圈各一個(gè)，并將橡皮圈套在大鼠大腿根部，并用尼龍?jiān)鷰翟谙鹌とο伦钃跸鹌とο蛳禄瑒?dòng)，尼龍?jiān)鷰Р粚?duì)骨骼肌產(chǎn)生壓力，當(dāng)大鼠趾掌變得蒼白青紫、發(fā)涼，即是股動(dòng)脈血流被成功阻斷，大鼠趾掌由暗紫色又轉(zhuǎn)為粉紅色則為恢復(fù)血流灌注。具體步驟如下：

①制備長(zhǎng)度為2 cm，內(nèi)徑為2 cm的塑料套管，外覆軟布圈(以防壓力集中使肌肉斷裂)，將直徑0.8 cm和1.0 cm橡皮圈各一個(gè)緊密套在塑料管上；

②由助手將大鼠固定牢靠，將大鼠右后肢充分套入上述制備完畢的塑料管內(nèi)(使橡皮圈能從大腿根部阻斷血流)，然后拉動(dòng)軟布圈使其帶動(dòng)其上的多個(gè)橡皮圈一起退至大鼠右后肢大腿根部，橡皮圈因彈性回縮壓迫股動(dòng)脈而阻斷右后肢的血流(阻斷大鼠后肢血流的標(biāo)志是趾掌變得蒼白青紫、發(fā)涼)；

③大鼠右后肢阻斷血流的時(shí)間為4 h以實(shí)現(xiàn)肢體處于缺血狀態(tài)，然后依次于缺血后0 h、2 h、4 h和8 h用手術(shù)刀片分別切斷橡皮圈，恢復(fù)血流灌注，構(gòu)建缺血-再灌注損傷模型，并可輕柔按摩橡皮圈固定處以利于恢復(fù)血液的灌注(見圖1)，并依次于缺血后再灌注0 h、2 h、4 h和8 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在大鼠處于麻醉狀態(tài)下采用頸椎脫臼法將其處死，收集腓腸肌，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片等操作后行HE染色和DAPI染色，光鏡下觀察腓腸肌組織結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化。

注：a：造模所需元件及組裝；b：阻斷右后肢股動(dòng)脈血流側(cè)位圖；c：阻斷右后肢股動(dòng)脈血運(yùn)前后位圖；d：維持缺血狀態(tài)4 h，右側(cè)趾掌變得蒼白青紫、發(fā)涼。圖1 大鼠肢體缺血-再灌注損傷模型操作示意圖Note. a: Materials and assembly for the model; b: Blocking blood flow of the right femoral artery in the lateral position; c: Blocking blood flow of the right femoral artery in the anteroposterior position; d: Pale and cool paw on the right hind limb during the ischemic state for 4 hours.Figure 1 Operational diagram of the establishment of the rat LIRI model

2 結(jié)果

2.1 肢體骨骼肌大體形態(tài)觀察

依次于缺血后再灌注0 h、2 h、4 h和8 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，然后沿大鼠右后肢縱軸方向剪開皮膚，鈍性分離皮膚軟組織等淺筋膜，切掉深筋膜，暴露腓腸肌。正常組3只大鼠腓腸肌鮮活紅潤(rùn)，肌組織結(jié)構(gòu)輪廓清晰；與正常組比較，再灌注0 h組、2 h組、4 h組及8 h組共計(jì)12只大鼠(每組3只，沒有未納入分析的大鼠)右后肢腓腸肌均有不同程度腫脹、瘀青，肌組織結(jié)構(gòu)模糊、暗淡，組織液化壞死等表現(xiàn)，而且隨著時(shí)間的進(jìn)展損傷逐漸加重(見圖2)。

注：a：正常組；b：0 h組；c：2 h組；d：4 h組；e：8 h組。圖2 后肢大體解剖形態(tài)觀察圖Note. a: Normal group; b: 0 h group; c: 2 h group; d:4 h group; e:8 h group.Figure 2 Gross appearance of the mouse hind limbs

2.2 HE染色結(jié)果

光鏡下對(duì)各組腓腸肌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，正常組3只大鼠腓腸肌細(xì)胞輪廓正常，胞膜完整，肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰(見圖3a)；與正常組相比，0 h、2 h、4 h和8 h組所有大鼠(每組3只，共計(jì)12只)右后肢腓腸肌肌纖維結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)異常，肌纖維排列紊亂、增粗、腫脹或部分肌纖維完整性、連續(xù)性遭到破壞，肌纖維變細(xì)、斷裂或肌纖維間縫隙增寬，肌纖維間炎性浸潤(rùn)，但各組損傷程度不一，其中0 h組和2 h組損傷程度較輕，而4 h組和8 h組較嚴(yán)重；4 h與8 h兩組正常骨骼肌細(xì)胞明顯減少，變性或壞死的骨骼肌細(xì)胞明顯增多(見圖3b～3e)。

注：a：正常組；b：0 h組；c：2 h組；d：4 h組；e：8 h組。圖3 腓腸肌染色形態(tài)光鏡圖(HE染色，× 200)Note. a: Normal group; b: 0 h group; c: 2 h group; d:4 h group; e:8 h group.Figure 3 Histology of the mouse gastrocnemius muscle. HE staining

2.3 DAPI染色結(jié)果

正常組3只大鼠腓腸肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形形狀，邊緣輪廓清晰，染色均勻(見圖4a)；除正常組外，其余4組所有大鼠(共計(jì)12只)右后肢腓腸肌細(xì)胞內(nèi)均可見凋亡小體,即核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細(xì)胞膜所包繞，細(xì)胞核邊緣不規(guī)則(見圖4b～4e)，其中尤以4 h和8 h兩組最為明顯；此外，4 h組中3只大鼠和8 h組中3只大鼠的腓腸肌細(xì)胞著色較重，核出現(xiàn)濃縮、呈新月形聚集于核膜一邊(見圖4c～4d)。

注：a：正常組；b：0 h組；c：2 h組；d：4 h組；e：8 h組。紅色箭頭指示凋亡小體；黃色箭頭指示核濃縮和新月形細(xì)胞核。圖4 腓腸肌細(xì)胞核熒光染色圖(DAPI染色，× 400)Note. a: Normal group; b: 0 h group; c: 2 h group; d:4 h group; e: 8 h group. Red arrowhead: apoptotic body; Yellow arrowhead: nuclear enrichment and crescent nucleus.Figure 4 Fluorescence images of cell nuclei of the gastrocnemius muscle. DAPI staining

3 討論

Jennings等[11]于1960年在心肌的研究中最早提出了缺血-再灌注損傷概念。之后諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺血再灌注損傷也可在心、腦、肝、腎、骨骼肌等其他器官組織中發(fā)生。近些年，有關(guān)缺血-再灌注損傷模型的構(gòu)建方法，在大鼠、小鼠、兔、豬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上均有報(bào)道，然而，無論是在常見的心、腦、肝、腎、腸道缺血-再灌注損傷模型[12 - 17]中，還是在骨骼肌缺血-再灌注損傷模型[18]中，大都均采用較為復(fù)雜的、開放有創(chuàng)的造模方法，即依次切開皮膚、皮下組織，顯露動(dòng)脈、靜脈和神經(jīng)，用顯微器械分離動(dòng)脈，通過無創(chuàng)血管夾夾閉或無創(chuàng)縫合線結(jié)扎相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)動(dòng)脈造成器官缺血，然后放開血管夾或剪斷縫合線，恢復(fù)阻斷區(qū)血供誘發(fā)再灌注損傷。然而，這種切開皮膚軟組織，游離營(yíng)養(yǎng)血管再結(jié)扎的開放造模方法，操作精細(xì)復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造模技術(shù)要求較高，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷較大。此外，在造模過程中對(duì)無菌條件要求高，易出現(xiàn)切口感染，誤傷神經(jīng)血管等問題，造模成功率較低。

而本實(shí)驗(yàn)中所描述的LIRI模型是在張連元等[19]介紹的方法基礎(chǔ)上，加入自制注射器套筒，精簡(jiǎn)步驟，細(xì)化操作，在大鼠體外閉合阻斷股動(dòng)脈血流誘發(fā)肢體缺血-再灌注損傷的一種方法。本造模方法血流阻斷部位在股骨近端，而取材部位是脛腓骨后面的腓腸肌，故而避免橡皮圈對(duì)腓腸肌的直接損傷，腓腸肌結(jié)構(gòu)形態(tài)上的異常變化應(yīng)是由阻斷股動(dòng)脈血運(yùn)再?gòu)?fù)灌血流而誘發(fā)骨骼肌發(fā)生缺血-再灌注損傷所導(dǎo)致。與當(dāng)前采用較多的開放有創(chuàng)的造模方法相比，本方法具有簡(jiǎn)便、快捷、安全、可靠等優(yōu)點(diǎn)。本方法在體外阻斷股動(dòng)脈，一方面實(shí)驗(yàn)人員無需進(jìn)行系統(tǒng)、精細(xì)的外科操作培訓(xùn)，另一方面對(duì)無菌條件要求相對(duì)較低，且對(duì)大鼠本身?yè)p傷較小，避免了因切開皮膚軟組織造模而產(chǎn)生的出血、感染、誤傷血管和神經(jīng)等問題，不僅可以降低風(fēng)險(xiǎn)，而且在保障造模質(zhì)量的前提下，通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法盡可能地減輕了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的損害，這正是善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、提高動(dòng)物福利，遵循“減少、替代、優(yōu)化”3R原則的具體體現(xiàn)。在本實(shí)驗(yàn)中，再灌注0 h、2 h、4 h和8 h四組骨骼肌均出現(xiàn)了不同程度肌纖維腫脹、炎性浸潤(rùn)、肌纖維排列不規(guī)則、變細(xì)、間隙增寬，甚至肌纖維斷裂等異常情況，表明在缺血-再灌注過程中骨骼肌結(jié)構(gòu)形態(tài)表現(xiàn)異常，骨骼肌出現(xiàn)不同程度損傷，其中4 h和8 h兩組損傷程度較之0 h和2 h兩組顯著加重，且8 h組損傷程度最為嚴(yán)重，說明骨骼肌損傷隨時(shí)間進(jìn)展性加重，缺血時(shí)間拖延越久，骨骼肌損傷越嚴(yán)重，LIRI危害也就越大，這或許就是LIRI“早期、及時(shí)、全程”治療思路的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，四組的骨骼肌細(xì)胞表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，這與在LIRI過程中有細(xì)胞凋亡機(jī)制參與的論述相一致[20 - 21]，表明在一定的病理?xiàng)l件下，如骨骼肌處于缺血缺氧環(huán)境中，骨骼肌細(xì)胞可以發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，在LIRI過程中長(zhǎng)時(shí)間的缺血缺氧狀態(tài)導(dǎo)致了核細(xì)胞自身啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)特定的程序誘發(fā)細(xì)胞自然死亡。凋亡的細(xì)胞體積則會(huì)整體縮小，細(xì)胞膜變得皺縮，或形成許多突起分割包裹胞質(zhì)，亦或核體皺縮，染色體致密，形成凋亡小體，細(xì)胞核最終破裂、解體。

綜合上述，本造模方法構(gòu)建的模型符合LIRI損傷過程中骨骼肌的病理變化特點(diǎn)，與LIRI臨床特征相似。且該模型操作簡(jiǎn)便、快捷、模型結(jié)果質(zhì)量可靠，從而為系統(tǒng)研究LIRI的病因、發(fā)病機(jī)制及其預(yù)防和治療，提供了一種接近臨床、簡(jiǎn)便可控的動(dòng)物建模方法。