1,25(OH)2VD3對Zucker糖尿病肥胖大鼠肝線粒體損傷的保護作用

李艷艷，馮里茹，張紅敏，譚洪興，朱李佳，王 俊

(深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是當前嚴重威脅人類健康的代謝性疾病，長期的代謝紊亂可引起全身多器官病變。肝是糖脂代謝的主要場所，也是胰島素作用的重要靶器官，肝損傷在DM發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用[1]。

糖尿病肝損傷機制復雜，其中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介導的氧化應激被認為是肝損傷的關鍵機制并貫穿始終[2]。線粒體是細胞內的能量供應中心，參與多種生理活動，然而，線粒體也是內源性ROS產生的主要部位[3]。糖尿病狀態(tài)下，高糖高脂加重了線粒體負荷，在呼吸鏈電子傳遞中產生的過量ROS將自身作為首要靶標導致線粒體結構破壞和功能障礙，進一步加劇ROS的積聚導致肝嚴重損傷，從而加重糖脂代謝的紊亂，形成惡性循環(huán)[4 - 5]。因此，減輕線粒體損傷、修復線粒體結構和功能對于防治糖尿病肝損傷具有重要意義。

線粒體生物合成(mitochondrial biogenesis)是核基因及線粒體基因協(xié)同調控下的重要生理活動，在線粒體結構修復及功能維持過程中發(fā)揮關鍵作用[6]。在糖尿病肝線粒體損傷情況下，增加線粒體生物合成對于恢復肝細胞正常糖脂代謝尤為重要。維生素D(vitamin D，VD)是一種脂溶性維生素，經肝、腎轉化成活性形式1,25(OH)2VD3后與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結合發(fā)揮多種生物學效應，在糖脂代謝過程中亦發(fā)揮重要的調節(jié)作用[7]。然而，維生素D能否通過線粒體生物合成改善糖尿病肝損傷及相關機制目前鮮有研究。因此，本研究以維生素D缺乏狀態(tài)下的Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠為對象，探討1,25(OH)2VD3對糖尿病肝線粒體損傷的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性自發(fā)性肥胖型2型糖尿病大鼠(ZDF大鼠)20只，體重(127.1±13.7) g，5～6周齡；SPF級雄性Zucker瘦型(Zucker lean，ZL)大鼠10只，體重(114.3±7.2) g，5～6周齡，購于維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK (京) 2016-0011]，動物飼養(yǎng)于華中科技大學實驗動物中心[SYXK (鄂) 2016-0057]。本研究通過華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物醫(yī)學倫理委員會審批(IACUC Number：432)。

1.2 主要試劑與儀器

1,25(OH)2VD3(Cayman)；2.5%戊二醛固定液(谷歌生物)；血清ALT、AST檢測試劑盒(南京建成)；MDA、GSH測定試劑盒(南京建成)；DHE熒光探針(南京碧云天)；線粒體提取試劑盒(碧云天)；四甲基羅丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM)(Sigma-Aldrich)；RIPA裂解液(碧云天)；總蛋白提取試劑盒(南京碧云天)；蛋白定量試劑盒(Bio-Rad)；SIRT1抗體、PGC-1α抗體、TFAM抗體、NRF1抗體(Abcam)；HRP標記抗小鼠IgG抗體、HRP標記抗兔IgG抗體(CST)；ECL化學發(fā)光劑(Millipore)。倒置顯微鏡(奧林巴斯)；透射電子顯微鏡(Hitachi)；化學發(fā)光成像儀(Bio-Rad)；熒光分光光度計(Thermo)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

所有大鼠在喂養(yǎng)過程中均按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。適應性喂養(yǎng)1周后，瘦型鼠為對照組(ZL)，胖型鼠按照體重隨機分為2組：模型組(ZDF)和維生素D干預組(ZDF + VD)，胖型鼠體重為105～152 g，分為105～110 g、111～120 g、121～130 g、130～140 g、141～152 g五個等級，然后將每個等級的大鼠隨機分為2組。喂養(yǎng)Zucker大鼠專用飼料Purina #5008(北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供)，在原飼料配方基礎上去除添加的維生素D；1,25(OH)2VD3溶于玉米油中根據體重每兩天灌胃1次，劑量為每千克體重5 μg(劑量根據預實驗確定)；ZL組與ZDF組大鼠灌胃等體積的玉米油。各組大鼠喂養(yǎng)至12周齡，喂養(yǎng)結束后，眼眶取血，迅速剝離肝，進行電鏡及病理觀察的固定，其他肝組織分裝于-80℃保存。

1.3.2 肝損傷指標檢測

按照血清ALT、AST檢測試劑盒操作步驟檢測各組大鼠血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)水平；HE染色觀察肝病理改變；硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定心臟丙二醛(MDA)水平，二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)比色法測定心臟谷胱甘肽(GSH)水平；肝ROS檢測：肝組織冰凍切片孵育DHE熒光探針，熒光顯微鏡觀察紅色熒光強度并拍照。

1.3.3 肝超微結構觀察

動物處死1 min內迅速切取截面積為1 mm2的5 mm肝組織長條，用2.5%的戊二醛緩沖液固定，經過處理后的切片用透射電子顯微鏡觀察肝超微結構，尤其是線粒體的損傷。

1.3.4 線粒體膜電位測定

取100 mg新鮮肝組織用線粒體提取試劑盒提取線粒體，使用100 nmol/L TMRM熒光染料孵育(37℃，30 min)后，用熒光分光光度計讀取熒光強度。

1.3.5 線粒體生成相關蛋白的檢測

Western blot檢測肝線粒體生成相關蛋白NRF1、TFAM表達量及上游調節(jié)蛋白SIRT1、PGC-1α的表達。稱取100 mg左右肝組織，加入10倍體積的RIPA裂解液提取總蛋白。蛋白濃度用BCA試劑盒測定。利用SDS-PAGE電泳分離蛋白后，通過濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。根據抗體說明書進行一抗和經HRP標記的二抗孵育。最后，加入ECL化學發(fā)光試劑進行顯色，利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行拍照和灰度統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 1,25(OH)2VD3改善ZDF大鼠肝損傷

血清ALT、AST是反映肝損傷的敏感指標。如圖1A所示：與ZL組相比，ZDF組大鼠肝細胞ALT、AST釋放水平顯著升高，血清ALT、AST水平約分別增加了8.3倍和6.8倍。1,25(OH)2VD3干預后明顯減輕了ZDF大鼠肝細胞ALT、AST的釋放。

喂養(yǎng)結束后，較ZL組相比，ZDF組大鼠肝出現(xiàn)明顯的病理改變，肝體積明顯增大，顏色變淺偏黃，HE染色結果顯示，ZL組大鼠肝小葉清晰，肝細胞索以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，沒有出現(xiàn)脂滴以及脂肪變性，細胞核為圓形，位于細胞中央；而ZDF組大鼠肝出現(xiàn)明顯的脂肪病變，彌漫性小泡脂滴幾乎占滿整個肝細胞；1,25(OH)2VD3干預有效緩解了ZDF大鼠肝病變。如圖1B所示。

注：A：大鼠血清轉氨酶水平。與ZL組比較，aP< 0.05；與ZDF組比較，bP< 0.05。B：大鼠肝組織HE染色(× 200)。圖1 1,25(OH)2VD3對大鼠血清ALT、AST及肝病理損傷的影響Note. A: Serum transaminases of Zucker rats. Compared with the ZL group,aP< 0.05. Compared with the ZDF group,bP< 0.05. B: Liver histology.HE staining (× 200).Figure 1 Effect of 1,25(OH)2VD3 on serum transaminases and liver histology in the Zucker rats

2.2 1,25(OH)2VD3改善ZDF大鼠肝氧化損傷

圖2A展現(xiàn)的是肝ROS水平，較ZL組，ZDF組大鼠肝組織孵育DHE探針后紅色熒光顯著增強，ROS的產生明顯升高。脂質過氧化產物——丙二醛(MDA)的水平能夠反映脂質氧化損傷程度，谷胱甘肽(GSH)則反映機體抗氧化水平，如圖2B所示，與ZL組相比，ZDF組大鼠肝MDA水平顯著上升而GSH水平明顯降低，1,25(OH)2VD3干預后，MDA水平降低了約25%，GSH水平升高了約41%，顯著緩解了ZDF大鼠肝氧化損傷。

注：A：大鼠肝組織ROS水平(× 200)。B：大鼠肝谷胱甘肽及丙二醛水平。與ZL組比較，aP< 0.05；與ZDF組比較，bP< 0.05。圖2 1,25(OH)2VD3對大鼠肝氧化損傷的影響A: Liver ROS detected under a fluorescence microscope (× 200). B: Liver GSH and MDA detected by spectrophotometry. Compared with the ZL group,aP< 0.05. Compared with the ZDF group,bP< 0.05.Figure 2 Effect of 1,25(OH)2VD3 on oxidative damage in the ZDF rat liver

2.3 1,25(OH)2VD3對ZDF大鼠肝線粒體結構及功能的影響

圖3A電鏡結果顯示：ZL組大鼠肝線粒體呈橢圓形、短棒狀或者圓形，大小均一；ZDF組大鼠肝細胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的脂滴，線粒體腫脹、形態(tài)異常并伴有空泡化；1,25(OH)2VD3干預后線粒體形態(tài)基本恢復正常。線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)是反映線粒體膜損傷及功能的重要指標，與ZL組相比，ZDF組大鼠肝MMP下降了約43%，1,25(OH)2VD3逆轉了線粒體膜通透性的改變，減輕了線粒體損傷(圖3B)。

2.4 1,25(OH)2VD3改善ZDF大鼠肝線粒體生物合成

線粒體生物合成對于機體維持和修復線粒體結構和功能具有重要意義。介導線粒體生物合成最重要的是PGC-1α及其下游轉錄因子NRF1和TFAM。如圖4所示，ZDF組大鼠肝組織中PGC-1α、NRF1及TFAM的表達比ZL組約分別降低了58%、38%及62%，此外，PGC-1α上游調節(jié)蛋白SIRT1的表達也顯著降低；1,25(OH)2VD3能夠上調線粒體生成相關調控蛋白SIRT1、PGC-1α及其下游NRF1和TFAM的表達，緩解ZDF大鼠肝線粒體穩(wěn)態(tài)失衡。

注：A：大鼠肝超微結構(× 3500)，紅色箭頭指示線粒體。B：大鼠肝線粒體膜電位水平。與ZL組比較，aP< 0.05；與ZDF組比較，bP< 0.05。圖3 1,25(OH)2VD3對ZDF大鼠肝線粒體損傷的保護作用Note. A: Liver ultrastructure of Zucker rats observed by transmission electron microscopy (× 3500). Red arrows indicate mitochondria.B: Liver mitochondrial membrane potential. Compared with the ZL group,aP< 0.05. Compared with the ZDF group,bP< 0.05.Figure 3 Protective effect of 1,25(OH)2VD3 on hepatic mitochondrial injury in the ZDF rats

注：與ZL組比較，aP< 0.05；與ZDF組比較，bP< 0.05。圖4 1,25(OH)2VD3對ZDF大鼠肝線粒體合成的影響Note. Compared with the ZL group,aP< 0.05. Compared with the ZDF group,bP< 0.05.Figure 4 Protective effect of 1,25(OH)2VD3 on hepatic mitochondrial biogenesis in the ZDF rats

3 討論

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，可導致全身多個器官損害，肝損傷就是其中主要的損傷之一。研究發(fā)現(xiàn)，約50%的糖尿病患者合并肝病變，肝損傷在糖尿病的發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮著重要作用[8]。ZDF大鼠是從出現(xiàn)糖尿病表型的Zucker大鼠中篩選并近親雜交培育出的一種自發(fā)性糖尿病模型鼠[9]，ZDF大鼠經高血脂高血糖、糖耐量異常、胰島素抵抗等程序化發(fā)展為2型糖尿病，被認為是2型糖尿病及并發(fā)癥研究的理想動物模型[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZDF大鼠血清ALT、AST水平異常升高，肝出現(xiàn)損傷，組織病理切片顯示，ZDF大鼠肝細胞出現(xiàn)嚴重的脂肪變性。

糖尿病肝損傷機制復雜，ROS介導的氧化應激備受關注。在高糖高脂狀態(tài)下，過量的ROS會攻擊蛋白質、脂質和核酸等生物大分子，導致肝細胞脂質過氧化，引起肝的病變[12]。研究認為，線粒體是細胞內ROS產生的主要場所，病理狀態(tài)下，呼吸鏈電子傳遞過程中大量產生的ROS將線粒體自身作為首要靶標，造成線粒體結構與功能的異常，加速ROS的生成，導致細胞嚴重的氧化損傷[13]。本研究電鏡結果顯示，ZDF大鼠線粒體出現(xiàn)腫脹、變性、空泡化，線粒體膜電位也隨之降低。與此同時，ZDF大鼠肝ROS產生顯著增多、脂質過氧化產物MDA含量升高，最嚴重的是肝的抗氧化能力卻逐漸下降，表現(xiàn)為GSH耗竭，這些結果提示ZDF大鼠肝出現(xiàn)明顯的氧化損傷。與以往研究結果相似，在STZ誘導的糖尿病大鼠肝細胞出現(xiàn)線粒體功能障礙及氧化損傷[14]，這些結果提示，線粒體結構及功能障礙可能在糖尿病肝損傷中起著關鍵作用。

線粒體生物合成是線粒體結構和功能修復的重要生理活動。介導線粒體生成最重要的調控因子為PGC-1α[15]，對機體線粒體生物合成及氧化應激的調控具有重要意義。此外，PGC-1α下游轉錄因子NRF1和TFAM也是調控線粒體合成與功能的關鍵分子，參與線粒體DNA的復制與轉錄[16]。研究顯示，在糖尿病大鼠視網膜病變中，線粒體損傷及ROS的增加與PGC-1α下降密切相關[17]。2型糖尿病ob/ob小鼠心肌細胞PGC-1α、NRF1及TFAM表達顯著降低并伴隨線粒體mtRNA拷貝數的減少與ROS產生的增加[18]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過乙酰化作用激活PGC-1α從而促進線粒體生物合成[19]。然而，在STZ誘導的糖尿病及db/db糖尿病小鼠模型腎組織中SIRT1表達與活性均顯著降低，上調能夠緩解氧化損傷、凋亡等病理改變[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著氧化應激及線粒體功能損害，ZDF大鼠肝線粒體生物合成關鍵分子PGC-1α及其下游NRF1及TFAM的表達明顯下降，PGC-1α的上游調控因子SIRT1的表達也顯著降低，提示ZDF大鼠肝損傷與線粒體生物合成受阻相關。

近年來，維生素D已成為糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要影響因素。維生素D經肝、腎轉化成活性形式1,25(OH)2VD3后與維生素D受體(VDR)結合，參與糖脂代謝，調節(jié)胰島素敏感性，在糖尿病及其并發(fā)癥的防治中具有重要意義[7]。此外，研究顯示，1,25(OH)2VD3可通過抗氧化、抗炎等多種機制緩解非酒精性肝損傷。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏會加速和加重ZDF大鼠的病情[21]，本實驗結果顯示，維生素D缺乏狀態(tài)下的ZDF大鼠肝出現(xiàn)了嚴重的氧化損傷及線粒體損害，1,25(OH)2VD3干預后肝損傷明顯緩解，ROS產生減少，線粒體結構及功能趨于正常。其他研究也發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2VD3能夠調節(jié)骨骼肌線粒體功能及其酶活性[22]。然而，目前關于1,25(OH)2VD3改善線粒體功能的相關機制鮮有報道。本研究顯示，1,25(OH)2VD3能夠上調線粒體生物合成關鍵蛋白SIRT1、PGC-1α及下游NRF1和TFAM的表達，修復ZDF大鼠肝由于高糖高脂引起的線粒體結構和功能損傷，同時緩解了肝氧化損傷。

綜上所述，1,25(OH)2VD3可通過上調SIRT1/PGC-1α通路增強線粒體生物合成，修復線粒體結構與功能，從而緩解了ZDF大鼠肝氧化損傷。本實驗為1,25(OH)2VD3防治糖尿病及肝損傷提供了新的理論基礎，1,25(OH)2VD3是如何調控SIRT1及更深入的機制需進一步實驗研究。