連續(xù)生物加工技術(shù)在生物制藥中的研究進(jìn)展

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(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

目前生物產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)大多為分批加工過程，分批加工可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量的離線檢測。但分批加工存在著設(shè)備占地面積大、前期投入成本高、操作繁瑣和成品質(zhì)量不穩(wěn)定等不足。隨著生物制藥行業(yè)的發(fā)展，對(duì)生物合成技術(shù)的要求也越來越高。以往傳統(tǒng)的批次生物加工方法已經(jīng)不能滿足當(dāng)今社會(huì)對(duì)于高產(chǎn)量、低污染的要求，批次加工向連續(xù)生物加工轉(zhuǎn)變已成為工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展趨勢[1]。連續(xù)生物加工概念于30多年前提出，是指利用連續(xù)的物料流動(dòng)通過各種單元操作達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，同時(shí)生產(chǎn)質(zhì)量均一產(chǎn)品的過程[2]。由于潛在優(yōu)勢眾多，連續(xù)生物加工在生物制藥行業(yè)的應(yīng)用日益廣泛[3]。

1 連續(xù)生物加工的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 連續(xù)生物加工的研究進(jìn)展

過去的10多年里，治療用蛋白藥物尤其是抗體相關(guān)產(chǎn)品的市場已經(jīng)發(fā)生了顯著的變化，生物醫(yī)藥市場增長率每年超過10%[4-6]。對(duì)藥效要求的提高以及個(gè)性化用藥趨勢的發(fā)展都導(dǎo)致藥物的產(chǎn)量降低[7]。重磅新藥品種研發(fā)難度的增加以及生物仿制藥發(fā)展帶來的競爭增大了生產(chǎn)商的成本壓力[6-10]。此外，制藥公司為向新興市場提供患者可負(fù)擔(dān)得起的藥物進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)高效生產(chǎn)過程的需求[11]。

據(jù)市場調(diào)研公司Evaluate Pharma預(yù)測，2018年全球處方藥銷售額將達(dá)到8 850 億美元，全球藥品研發(fā)支出預(yù)計(jì)達(dá)到1 490 億美元。未來生物制藥行業(yè)充滿機(jī)遇，因此對(duì)生產(chǎn)過程也就有了更高的要求[12]。為保持或加強(qiáng)市場地位，生物制藥工業(yè)將依靠低成本和靈活的生產(chǎn)設(shè)施以適應(yīng)市場發(fā)展。與批次加工系統(tǒng)相比，利用連續(xù)生物加工的系統(tǒng)具有降低制造成本、簡化制造設(shè)備規(guī)模、改善產(chǎn)品質(zhì)量以及再生和標(biāo)準(zhǔn)化終產(chǎn)品等明顯的優(yōu)勢[13]。其中最大的優(yōu)勢是增加了設(shè)備靈活性和降低了成本。生產(chǎn)規(guī)模上的靈活性是指可生產(chǎn)包含大批量和小批量藥物在內(nèi)的廣泛產(chǎn)品組合[14]。Walther等[15]指出：相對(duì)于傳統(tǒng)的批次加工，連續(xù)生物制造過程可以降低55%的成本，例如利用連續(xù)生物加工技術(shù)生產(chǎn)非單克隆抗體產(chǎn)品，運(yùn)營成本可從批次處理的每克1 230 美元降到每克250 美元。Hammerschmidt等[16]指出：使用標(biāo)準(zhǔn)的批次過程生產(chǎn)單克隆抗體，色譜純化一、二期的總成本為5 500 萬美元，而使用基于連續(xù)沉淀純化的連續(xù)過程時(shí)，色譜純化一、二期的總成本花費(fèi)僅為1 600 萬美元，成本降低了70%以上。連續(xù)生產(chǎn)的大部分成本優(yōu)勢來自于更少的生產(chǎn)設(shè)備和占地面積的投入。較小的生產(chǎn)規(guī)模有利于提高容量利用率、減少產(chǎn)品轉(zhuǎn)換、簡化生產(chǎn)放大過程[17]。表1總結(jié)了批次生物加工與連續(xù)生物加工的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 批次生物加工與連續(xù)生物加工的比較

連續(xù)生物加工目前還處于探索階段，從批次加工到準(zhǔn)連續(xù)加工再到連續(xù)加工是一個(gè)漸進(jìn)、探索的過程。在未來，為了降低成本和提高生產(chǎn)力，小規(guī)模的綜合連續(xù)加工步驟可以作為當(dāng)前批次加工的一種替代方案。而對(duì)于一些中小企業(yè)而言，將原傳統(tǒng)批次加工生產(chǎn)完全轉(zhuǎn)換為連續(xù)生物加工，需要開發(fā)全新的上游加工流程和下游單元操作設(shè)備，投入較大[14]。因此，采用半連續(xù)生物加工是探索連續(xù)生物加工階段的一個(gè)較好選擇。Pollock[21]提出了一種綜合實(shí)驗(yàn)方法和模型，用于評(píng)估半連續(xù)色譜法獲取單克隆抗體在臨床和商業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，過渡方法可以是連續(xù)的上游處理結(jié)合傳統(tǒng)的批次下游處理，也可以是完整的連續(xù)下游處理與批次的上游處理整合。早在1995年，Yamane等[22]就將半連續(xù)的部分流程整合到批次加工系統(tǒng)中，用于種子的培養(yǎng)和生產(chǎn)。采用連續(xù)上游加工是為了消除潛在的可以限制細(xì)胞生長和生存能力的有毒代謝產(chǎn)物，維護(hù)恒定的營養(yǎng)水平，不僅可以減小對(duì)敏感細(xì)胞壓力，且除去發(fā)酵液中不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)可以消除種子退化的風(fēng)險(xiǎn)。

1.2 連續(xù)生物加工的應(yīng)用現(xiàn)狀

上游連續(xù)加工已在單克隆抗體等生物制品的生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。Rodriguez等[23]利用上游連續(xù)加工生產(chǎn)干擾素，采用的連續(xù)灌注法在改善了產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)也縮短了培養(yǎng)時(shí)間，降低了抑制濃度，由此提高了生產(chǎn)力。Luttmann等[14]將一個(gè)完整的連續(xù)下游加工整合到原有的批次循環(huán)上游過程，組成半連續(xù)生物加工過程，以畢赤酵母作為宿主系統(tǒng)生產(chǎn)瘧疾疫苗，取得較好的成效。輝瑞公司利用連續(xù)和半連續(xù)培養(yǎng)工藝生產(chǎn)抗血友病藥物重組抗血友病因子ReFacto AF和重組人凝血因子IX，結(jié)果表明連續(xù)加工過程不但增加了設(shè)備的操作靈活性，還確保了細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性[24]。

利用連續(xù)生物加工生產(chǎn)單克隆抗體、非單克隆抗體、治療蛋白、重組細(xì)胞、干細(xì)胞、凝血因子以及瘧疾疫苗等藥物方面的嘗試，對(duì)未來連續(xù)生物加工的技術(shù)成熟和全面商業(yè)運(yùn)用提供了經(jīng)驗(yàn)。Castilho[25]通過灌注細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組治療蛋白的過程探索了連續(xù)生物加工的整合過程。Jungbauer[26]介紹了生物制藥的下游加工過程中的相關(guān)裝置，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用提供指導(dǎo)和借鑒，圖1～3為生物制藥連續(xù)下游加工的流程及其相關(guān)設(shè)備。圖1顯示細(xì)胞分解后經(jīng)連續(xù)的重折疊，純化修正獲得重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)流程。圖2，3是重組蛋白連續(xù)的下游離心設(shè)備及過濾設(shè)備，通過連續(xù)的離心和過濾處理，能進(jìn)一步提高重組蛋白生產(chǎn)的效率及靈活性。圖2中箭頭表示溶液的流向，彎曲的箭頭和虛線分別表示自旋方向和自旋軸。

圖1 重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)下游加工的總流程Fig.1 General process of downstream processing for recombinant protein

圖2 用于重組蛋白生產(chǎn)下游加工的典型離心設(shè)備Fig.2 Typical centrifuge configurations used in downstream processing of recombinant protein

圖3 連續(xù)過濾單元操作及其相關(guān)設(shè)備Fig.3 Continuous filtering unit operation and related equipment

Zydney[27]綜述了適合連續(xù)下游生物加工的最新分離技術(shù)，著重介紹了最適合單克隆抗體等分泌蛋白生產(chǎn)的單元操作，對(duì)高價(jià)值生物制品的連續(xù)下游加工作了回顧。Rathore[28]綜述了2005—2015 年間連續(xù)生物加工的主要進(jìn)展，介紹了上游和下游連續(xù)生物加工的各種設(shè)備，對(duì)其應(yīng)用和優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了討論，結(jié)果見表2。

表2 連續(xù)生物處理上下游處理設(shè)備及其優(yōu)缺點(diǎn)

Walther等[15]探索了用連續(xù)生物處理進(jìn)行重組蛋白生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，并對(duì)連續(xù)生產(chǎn)單克隆抗體(mAb)和非單克隆抗體(non-mAb)進(jìn)行了定量和定性的比較，結(jié)果見表3，4。

表3 生物工藝及相關(guān)設(shè)備說明Table 3 Description of biological processes and related equipment

表4 對(duì)批次和連續(xù)平臺(tái)的高水平過程假設(shè)Table 4 High-level process assumptions for both conventional and continuous platforms

Godawat等[29]構(gòu)建了一個(gè)完整的端對(duì)端(end-to-end，端對(duì)端)連續(xù)生物加工系統(tǒng)，該系統(tǒng)是一個(gè)耦聯(lián)兩個(gè)周期性逆流色譜系統(tǒng)的連續(xù)灌注生物反應(yīng)器，并用于單克隆抗體生產(chǎn)。圖4是連續(xù)上游加工結(jié)合傳統(tǒng)批次下游加工的組合生產(chǎn)方式，相對(duì)于整個(gè)過程的批次加工，連續(xù)上游加工過程消除了潛在的有毒代謝產(chǎn)物，一定程度上提高了設(shè)備的靈活性；圖5是完全連續(xù)生物加工過程，相對(duì)于圖4的生產(chǎn)方式，這種連續(xù)加工系統(tǒng)精干、靈活，可控性強(qiáng)，簡化了操作步驟，節(jié)省了成本，更適于過程優(yōu)化和控制。

圖4 連續(xù)上游加工和捕獲組合批次下游加工Fig.4 Continuous upstream+capture, batch downstream

圖5 端對(duì)端連續(xù)上游加工組合連續(xù)下游加工Fig.5 End-to-end continuous upstream and downstream

連續(xù)灌注技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)重組凝血因子上的成功應(yīng)用已有20多年歷史[24]。Xenopoulos等[30]描述了一個(gè)連續(xù)的下游純化過程并對(duì)相關(guān)產(chǎn)品成本進(jìn)行了分析，相對(duì)于傳統(tǒng)下游純化過程，新型的下游純化過程在連續(xù)加工模式時(shí)，商業(yè)運(yùn)營和臨床操作相比批次加工模式能節(jié)省更多成本。Dutta等[31]成功利用連續(xù)逆流切向色譜方法從澄清細(xì)胞培養(yǎng)濃縮液中提取兩種不同的單克隆抗體。Girard等[32]利用序貫多柱色譜法優(yōu)化了單克隆抗體的純化工藝。Hardick等[33]開發(fā)了利用納米纖維吸附劑連續(xù)純化單克隆抗體的技術(shù)。Cunha等[34]使用連續(xù)灌注培養(yǎng)結(jié)合連續(xù)濃縮和透析過濾來高效濃縮和收集人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，是連續(xù)生物加工概念在細(xì)胞治療方面的成功應(yīng)用之一。Klutz等[35]闡述了連續(xù)生物處理設(shè)計(jì)中涉及的概念并建立了上游和下游過程的半工業(yè)規(guī)模設(shè)施，以期用于商業(yè)生產(chǎn)。Miotto等[36]開發(fā)了連續(xù)的生物加工方法生產(chǎn)基質(zhì)細(xì)胞，這是目前最為前沿的技術(shù)，也再一次擴(kuò)大了連續(xù)生物加工的應(yīng)用范圍。Patil等[37]總結(jié)了藥用蛋白生產(chǎn)連續(xù)加工上下游技術(shù)，介紹了連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)和連續(xù)色譜技術(shù)等一系列連續(xù)生物加工相關(guān)的連續(xù)操作。這些連續(xù)操作保證了連續(xù)生物加工更好地發(fā)揮優(yōu)勢，為生物制劑及藥物生產(chǎn)服務(wù)。

生物連續(xù)加工目前還沒有覆蓋所有藥物生產(chǎn)領(lǐng)域，但已經(jīng)被不斷地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。目前生物連續(xù)加工已成功應(yīng)用于生物醫(yī)藥的生產(chǎn)[38]，由于其突出的優(yōu)勢和廣闊的前景，除在生物制藥、生物合成等領(lǐng)域繼續(xù)發(fā)揮重要作用外，還將在更多相關(guān)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

2 連續(xù)生物加工的機(jī)遇及挑戰(zhàn)

目前有兩個(gè)主要驅(qū)動(dòng)因素推動(dòng)人們對(duì)連續(xù)生物加工的關(guān)注。首先在經(jīng)濟(jì)上，生物制藥商面臨著降低生物治療藥物價(jià)格方面的壓力，特別是要增加對(duì)發(fā)展中國家救命藥物的供應(yīng)；其次是來自低成本制造商日益激烈的競爭，他們中很多著重于對(duì)專利保護(hù)到期生物藥物的仿制[39]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012—2018 年專利到期仿制藥進(jìn)入市場帶來的風(fēng)險(xiǎn)損失超過2 900 億美元。由于很多新藥專利相繼到期，近年來，各大制藥企業(yè)應(yīng)對(duì)生物仿制藥的壓力也越來越大[12]。

一些研究表明：生物仿制藥也可以受益于連續(xù)生物加工。生物仿制藥開發(fā)的目的是使產(chǎn)品達(dá)到原研藥品質(zhì)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性要求。在一個(gè)傳統(tǒng)的批次生物加工過程中，來自于不同培養(yǎng)階段的蛋白亞型混合物需要被分離或者混合，從而獲得合適的目標(biāo)藥物，這可以通過維持恒定、穩(wěn)定培養(yǎng)條件的連續(xù)灌注加工來實(shí)現(xiàn)。在反應(yīng)過程的開始或者結(jié)束時(shí)會(huì)有副產(chǎn)品生成，但是可以通過連續(xù)的灌注流過程將其去除。Dorvignit等[40]利用連續(xù)灌注過程培養(yǎng)重組鼠骨髓瘤細(xì)胞生產(chǎn)利妥昔單抗生物仿制藥，產(chǎn)物生物學(xué)特性優(yōu)于原研產(chǎn)品。不過，大眾對(duì)于尋找能降低新藥研發(fā)、臨床試驗(yàn)以及生產(chǎn)等各方面成本的生產(chǎn)方式還是越來越感興趣。FDA因?yàn)檫B續(xù)生物加工能夠減少對(duì)生產(chǎn)流程的人工干預(yù)并且改善過程控制而對(duì)其大力支持。

盡管連續(xù)生物加工有很多優(yōu)勢，目前其推廣應(yīng)用仍有一些限制。許多相關(guān)的教科書已經(jīng)回答了為什么在目前的大環(huán)境下許多工廠企業(yè)仍然大量使用批次生產(chǎn)而不是連續(xù)生物加工的問題。目前連續(xù)生物加工主要存在以下不足[41]：連續(xù)反應(yīng)器的均質(zhì)性差，包括營養(yǎng)物質(zhì)的不足或局部細(xì)胞積累；實(shí)現(xiàn)長期無菌連續(xù)操作存在困難；連續(xù)生物加工設(shè)備長時(shí)間的運(yùn)行導(dǎo)致在短期加工多種產(chǎn)品時(shí)設(shè)備靈活性不足；在實(shí)驗(yàn)室中，用復(fù)雜的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行過程開發(fā)試驗(yàn)所需成本高、耗時(shí)長；細(xì)胞存在遺傳不穩(wěn)定性。

連續(xù)操作為實(shí)時(shí)過程監(jiān)控和自動(dòng)化控制領(lǐng)域帶來了機(jī)遇，特別是色譜操作的連續(xù)處理在縮減反應(yīng)器尺寸和降低成本的同時(shí)，能更有效地利用昂貴的色譜填充介質(zhì)。傳統(tǒng)的分批補(bǔ)料方法需要關(guān)閉過程控制來使中間產(chǎn)物釋放到下一步流程，而這一過程不適用于連續(xù)生物加工。連續(xù)生物加工所需的是能即時(shí)傳輸數(shù)據(jù)并可用于自動(dòng)或半自動(dòng)過程控制的快速、理想的在線過程分析技術(shù)，所以如何實(shí)現(xiàn)連續(xù)生物加工的精確控制目前是一個(gè)需要重點(diǎn)研究的課題。連續(xù)生產(chǎn)過程控制除了實(shí)時(shí)監(jiān)控pH、溫度和溶解氧等標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)之外，若能獲取細(xì)胞濃度和活力、主要營養(yǎng)物質(zhì)以及代謝副產(chǎn)物的實(shí)時(shí)信息將會(huì)使其更實(shí)用。為此，Mercier等[42]利用介電光譜法、近紅外光譜法對(duì)連續(xù)灌注細(xì)胞培養(yǎng)過程進(jìn)行分析檢測，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)生物加工的過程控制。

3 結(jié) 論

最近，越來越多的生物制藥公司致力于在生產(chǎn)過程中建立連續(xù)的加工過程。行業(yè)競爭和政府監(jiān)管帶來的壓力推動(dòng)了該行業(yè)對(duì)連續(xù)生物加工技術(shù)的創(chuàng)新和實(shí)施。目前，實(shí)現(xiàn)一個(gè)綜合連續(xù)生物加工平臺(tái)所必需的模塊大部分已經(jīng)建立。然而，在連續(xù)生物加工成功商業(yè)應(yīng)用之前，還有技術(shù)瓶頸需要攻克。這些挑戰(zhàn)包括更好的在線過程分析技術(shù)、細(xì)胞系穩(wěn)定性、實(shí)現(xiàn)長期無菌操作所需設(shè)備的可靠性、縮小模型的可靠性、強(qiáng)大的自動(dòng)化以及對(duì)所有單元操作的全局過程控制。這些技術(shù)挑戰(zhàn)可以通過行業(yè)、學(xué)術(shù)界和監(jiān)管機(jī)構(gòu)之間的共同努力合作解決。盡管從批次加工轉(zhuǎn)變到連續(xù)加工過程可能并不簡單，但是連續(xù)加工所帶來的長遠(yuǎn)利益可以證明其對(duì)生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

本文得到了浙江工業(yè)大學(xué)生物工程設(shè)備專業(yè)核心課程建設(shè)計(jì)劃(浙工大教〔2016〕69號(hào))，浙江工業(yè)大學(xué)研究生教學(xué)研究與教學(xué)改革項(xiàng)目(浙工大研〔2016〕15號(hào))，浙江工業(yè)大學(xué)本科生教學(xué)研究與教學(xué)改革項(xiàng)目(KG201623)，浙江工業(yè)大學(xué)大學(xué)生校外實(shí)踐教育基地建設(shè)項(xiàng)目(SJJD1718，SJJD1719，SJJD1720)的資助。