人參病害生防細菌分離 鑒定及其抑菌活性測定△

張曉云，丁萬隆，王蓉，李勇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬藥用植物，我國傳統(tǒng)名貴中藥材，主產(chǎn)于我國東北地區(qū)。根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2010版)[1]記載，人參具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效。近年，由于人參被列入藥食同源名錄，市場多元化導(dǎo)致人參需求量逐年增加，人參種植規(guī)模也是逐年攀升，這為人參致病菌繁衍和傳播創(chuàng)造了有利條件，病害問題愈發(fā)凸顯，對人參產(chǎn)量及品質(zhì)威脅較大[2]。

目前，防治人參病害主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，不合理用藥常導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標、生態(tài)環(huán)境污染以及病菌抗藥性等[3]問題。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌等[3]通過營養(yǎng)競爭、空間競爭、重寄生、合成抗生素等途徑，實現(xiàn)對植物病害的控制ADDINEN.CITE.DATA[4-5]。另外，生防菌合成的次生代謝物還具有植物促生長作用。實踐證明，生物防治是化學(xué)防控的有效替代方案之一。目前，市場上商品化微生物菌劑種類繁多、質(zhì)量參差不齊，是否對人參等中藥材病害有理想防效尚需驗證。鑒于人參病害田間防效評價受季節(jié)限制，周期長、成本高、評價結(jié)果易受環(huán)境因子影響，本研究直接從商品菌劑中分離菌株，通過對峙培養(yǎng)方法快速驗證菌株的抑菌活性，間接評價菌劑的生防潛力，為人參病害綠色防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans、人參菌核菌Sclerotiniaschinseng、人參黑斑菌Alternariapanax、人參根腐菌Fusariumoxysporum、人參疫病菌Phytophthoracactorum(Leb.et Coh.)Schroet、人參灰霉菌BotrytiscinereaPers.、人參立枯絲核菌RhizoctoniasolaniKuhn，由課題組保存。

1.2 供試菌劑

“KDL”復(fù)合微生物菌劑；“QM”微生物菌劑1號；“GGB”微生物菌劑。

1.3 分離純化

用無菌蒸餾水將微生物菌劑梯度稀釋成質(zhì)量濃度為1×104、1×103、1×102、10 mg·L-1的菌懸液，分別取100 μL，均勻涂布于LB培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h。觀察菌落生長情況，挑取不同顏色、形態(tài)的單菌落劃線培養(yǎng)，純化后-80 ℃保存、備用。

1.4 抑菌活性篩選

采用對峙培養(yǎng)法。PDA平板中心畫十字線，在十字線距離邊緣1 cm處接種待測菌株，中心接種人參致病菌。25 ℃恒溫黑暗倒置培養(yǎng)。只在PDA培養(yǎng)基中心接種人參致病菌作為空白對照。每個處理3次重復(fù)。對峙培養(yǎng)5 d～7 d后，測量病菌菌落半徑和抑菌帶寬。

(1)

1.5 生防細菌的鑒定

1.5.1 顯微形態(tài)觀察 取待測菌液5 mL，5000 r·min-1離心3 min，棄上清。PBS重懸細胞，離心，重懸于1 mL 2.5%的戊二醛中，4 ℃放置過夜，離心棄上清。用1 mL PBS緩沖液洗滌細胞沉淀3次，離心前室溫震蕩15 min，棄上清。再分別用1 mL 50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇洗滌細胞沉淀，離心前室溫放置10 min。用1 mL叔丁醇洗滌細胞3次，靜置過夜，將細胞均勻涂于蓋玻片上，真空冷凍干燥，噴金觀察。

1.5.2 基因序列分析 引物gyrA-f(5′-CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3′)和gyrA-r(5′-CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3′)用于細菌gyrA基因擴增[6]。PCR反應(yīng)體系50 μL，包括：10×PCR Buffer(100 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1Mg2+，pH8.3)5 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.25 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)4 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各2 μL，模板DNA(菌懸液)4 μL，ddH2O補足剩余體積。PCR程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。簡并引物UP-1S(5′-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3′)和UP-2Sr(5′-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCN GTA T-3′)用于細菌gyrB基因擴增[7]。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括：10×Ex Taq Buffer(含Mg2+)2.5 μL，TaKaRa Ex Taq(5 U·μL-1)0.25 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)1 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各2 μL，模板DNA(菌懸液)1 μL，ddH2O補充剩余體積。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

基因擴增產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(TIANGEN)回收，回收條帶連接T-vector PMD 19載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。菌落PCR檢驗有目的基因插入的陽性轉(zhuǎn)化子，用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)提取質(zhì)粒，交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

Excel 2007用于菌株抑菌活性分析及圖表繪制；SPSS 20.0軟件用于顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征

最終從“KDL”復(fù)合微生物菌劑分離到12株細菌(編號Y1～Y12)，“QM”微生物菌劑1號和“GGB”微生物菌劑未分離到活體菌株。分離菌株在LB培養(yǎng)基上呈圓形、不光滑、不透明、邊緣不規(guī)則鋸齒狀、表面有大量皺褶，乳白色至微黃色，無可溶性色素。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株均呈短棒狀或桿狀，單生，兩端鈍圓，(1.278～3.302)μm×(0.515～1.171)μm。

2.2 菌株抑菌活性

對峙培養(yǎng)結(jié)果表明，菌株Y1～Y11對七種人參致病菌均有抑菌活性(表1)，菌株Y12無抑菌活性。其中，Y2對人參疫病菌、人參黑斑菌、人參灰霉菌和人參銹腐菌的抑菌率最高(分別為68.25%±1.81%、52.58%±1.68%、49.46%±2.25%和40.65%±3.26%)；Y4對人參菌核菌的抑菌率最高(68.42%±3.04%)；Y9對人參立枯病菌的抑菌率最高(54.07%±3.39%)；Y3對人參根腐菌的抑菌率最高(47.37%±3.95%)。

表1 生防菌株對人參致病菌的抑菌率±s，n=3)

注：表中同列數(shù)據(jù)不含相同字母表示存在顯著差異(P<0.05)。

圖1 分離菌株對人參致病菌的抑菌活性

由圖1可見，分離菌株對人參疫病菌的抑菌能力最強，其中Y9抑菌帶寬24.0 mm，Y2次之，Y1抑菌帶最窄(20.0 mm)。除人參疫病菌外，分離菌株對人參黑斑菌、人參灰霉菌和人參菌核菌的抑菌能力也較強，其中Y2對人參黑斑菌、人參灰霉菌的抑菌帶寬分別為15.83 mm和12.33 mm，Y5對人參菌核菌的抑菌帶寬達15.5 mm。上述菌株對人參銹腐菌、人參根腐菌和人參立枯絲核菌的抑菌能力相對較弱，抑菌帶寬僅5.83～11.75 mm。

2.3 菌株鑒定

經(jīng)PCR擴增，得到長度為977 bp的gyrA基因片段。序列比對發(fā)現(xiàn)，菌株Y1與枯草芽孢桿菌B.subtilis(CP016894，KX281184)同源性最高(100%)；菌株Y8與枯草芽孢桿菌B.subtilis(CP022391，CP021985)同源性最高(99%)。其他菌株僅鑒定到芽孢桿菌屬Bacillusspp.。經(jīng)PCR擴增，得到長度為686 bp～711 bp的gyrB基因片段。經(jīng)序列比對，菌株Y2與枯草芽孢桿菌B.subtilis(CP018173.1)序列同源性最高(100%)；菌株Y3～Y7、Y9～Y11與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens(KF421826)同源性最高(100%)。

綜合菌株形態(tài)學(xué)特征以及gyrA、gyrB基因序列比對結(jié)果，鑒定Y1、Y2、Y8為枯草芽孢桿菌B.subtilis；Y3～Y7、Y9～Y11為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens。

3 討論

病害問題一直是困擾人參產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。針對人參病蟲害問題，目前主要通過農(nóng)業(yè)措施[8]、化學(xué)防治[9-10]等手段加以預(yù)防和控制，但實際生產(chǎn)中暴露出嚴重的農(nóng)殘超標、生態(tài)環(huán)境污染以及潛在的病菌和害蟲害抗藥性等問題。充分利用自然界天敵生物，通過生物防治手段解決中藥材病蟲害問題，是實現(xiàn)中藥材產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵[11]。芽孢桿菌是農(nóng)作物病害防治中應(yīng)用較為廣泛的一類生防菌，其能在植物根際快速定殖，并通過生態(tài)位點競爭、誘導(dǎo)植物抗病性、合成抗生素、植物促生長等途徑減輕病害的發(fā)生與為害ADDINEN.CITE.DATA[12-13]。本研究對三種商品微生物菌劑進行考察，發(fā)現(xiàn)僅有一種能夠分離出活體菌株，且大部分菌株均對人參致病菌有較為理想的抑菌活性，說明市售微生物菌劑質(zhì)量參差不齊，盲目選用可能會帶來較大病害防控風險。根據(jù)已有研究報道，前人已從人參內(nèi)生菌及人參根際土壤中分離到對人參致病菌有較好抑制作用的菌株，本研究分離的生防細菌對人參疫病菌、人參菌核菌和人參黑斑菌的抑菌活性略高于先前報道的生防菌株ADDINEN.CITE.DATA[14-16]，但對其余四種人參致病菌的抑菌活性較已報道的生防細菌ADDINEN.CITE.DATA[15-17]、生防真菌ADDINEN.CITE.DATA[18-19]及放線菌ADDINEN.CITE.DATA[20-22]略低。考慮到該菌劑產(chǎn)品對全部供試人參致病菌均有抑菌活性，且對部分人參致病菌的抑菌活性較高，說明該產(chǎn)品具有較好的病害生防潛力，可嘗試用于人參病害的田間防治。

與真菌不同，僅依靠菌落形態(tài)和培養(yǎng)性狀往往很難鑒定細菌的歸屬。根據(jù)以往研究，細菌鑒定常常需要參考生理生化指標特征以及特定基因序列[23]。16S rDNA是細菌鑒定最常用到的基因區(qū)段，但是僅靠該區(qū)段核酸序列往往難以區(qū)分親緣關(guān)系較近的菌株[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，僅通過16 S rDNA基因序列無法區(qū)分解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌。根據(jù)已有報道，細菌蛋白編碼基因(如rpoB、gyrA、gyrB、cheA、phoR等)較16 S rDNA具有更高的基因進化速率，其可能在近緣物種鑒定時發(fā)揮重要作用ADDINEN.CITE.DATA[25，26]。為此，本研究又擴增了DNA促旋酶A蛋白編碼基因gyrA和gyrB，成功將枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌準確區(qū)分。上述結(jié)果表明，gyrA、gyrB基因在細菌近緣種的鑒別上具有較16 S rDNA基因更高的分辨能力。