炎寧糖漿體內(nèi)外抗菌實(shí)驗(yàn)研究△

楊燕妮，曹景文，王毅，孫曉波，匡海學(xué)，王艷紅，劉恩臨，舒尊鵬，*

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；4.哈爾濱市康隆藥業(yè)有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150025)

隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，多種由致病菌引起的細(xì)菌感染性疾病有了很好的控制和治療效果，但抗菌藥物在發(fā)揮強(qiáng)大抗菌功效的同時(shí)，致病菌也不斷對(duì)現(xiàn)有藥物產(chǎn)生適應(yīng)性，即耐藥性?？咕幬锏臑E用，使細(xì)菌的耐藥性迅速產(chǎn)生，且抗生素的使用還存在療程過(guò)長(zhǎng)、更換頻繁、盲目選用、多種聯(lián)合等問(wèn)題，導(dǎo)致多重耐藥及泛耐藥菌株不斷增加，可供臨床選擇的抗生素越來(lái)越局限。因此從中藥中篩選抗菌藥物進(jìn)行細(xì)菌的非抗生素治療研究具有重要意義。相較中藥單味藥而言，中成藥制劑含有多種有效抗菌成分，具有多向性、多層面、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，使菌難以同時(shí)產(chǎn)生對(duì)抗多種抗菌成分的多重突變，能有效達(dá)到治療目的。

炎寧糖漿由鹿茸草、白花蛇舌草和鴨跖草3味中藥組成，臨床上主要用于上呼吸道感染、扁桃體炎、尿路感染、急性菌痢、腸炎等癥[1-2]。針對(duì)上述的感染性疾病，炎寧糖漿總提取物及其單味藥是否具有抗菌活性，又對(duì)哪些細(xì)菌具有殺菌效果，3種單味藥中哪味中藥抗菌效果最好？出于這些考慮，本文研究了炎寧糖漿總提取物對(duì)綠膿桿菌等12種常見(jiàn)細(xì)菌和白色念珠菌等4種真菌的體外抗菌效果以及對(duì)福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌造成的小鼠全身性感染致死率的影響，進(jìn)一步為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及試劑

炎寧糖漿組成所需的3種中藥由哈爾濱市康隆藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，并由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系李書(shū)淵教授鑒定為玄參科鹿茸草屬多年生草本植物鹿茸草MonochasmasheareriMaxim.ex Franch.、茜草科耳草屬多年生草本植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.、鴨跖草科鴨跖草屬多年生草本植物鴨跖草Commelinacommunis，樣本留存在廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院(樣品號(hào)分別為20170712A、20170712B和20170712C)。

蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20171001)、牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20171009)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20171012)、氯化鈉(西安化學(xué)試劑廠，批號(hào)：170128)、75%乙醇(山東利爾康消毒科技股份有限公司，批號(hào)：20170415)、DMSO(二亞基亞砜)(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20171023)、阿司匹林(濟(jì)南永寧制藥股份有限公司，批號(hào)：170504)。

1.2 動(dòng)物及菌株

SPF級(jí)ICR種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(粵)20170029。細(xì)菌(12種)：綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，購(gòu)于黑龍江省微生物檢疫所菌種保藏中心；大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、福氏痢疾桿菌(Shigellaflexneri)、志賀氏菌(Shigella)、表皮葡萄球菌(白色葡萄球菌)(Staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(檸檬色葡萄球菌)(Staphylococcussaprophyticus)、乙型副傷寒桿菌(Bacillusparatyphosus)、乙型溶血性鏈球菌(Betahemolyticstreptococcus)，購(gòu)于北京市微生物檢疫所。真菌(4種)：白色念珠菌(Candidaalbicans)、曲霉菌(Aspergillus)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、球孢子菌(Coccidiodes)，購(gòu)于北京市微生物檢疫所。

1.3 儀器

YXQ-LS-50 S II型全自動(dòng)立式壓力蒸氣滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、BI01500-II-A2型生物安全柜(上海振梓創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司)、DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、TCP010096型96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(BIOFIL公司)、9 cm一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)、10～200 μL微量移液器(Mettler Toledo公司)、D33型孔徑0.22 μm一次性無(wú)菌超微濾器(Millipore公司)。

2 方法

2.1 藥液的制備

按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版進(jìn)行藥品提取濃縮，即3味中藥按照鹿茸草、白花蛇舌草和鴨跖草2∶1∶1(共200.0 g)加水回流煎煮兩次，第一次煎煮1.5 h，第二次煎煮1 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.10，加乙醇使含醇量達(dá)到60%，攪勻，靜置12 h，濾過(guò)，減壓揮干成粉(16.0 g，出膏率8.0%)。另取鹿茸草、白花蛇舌草、鴨跖草藥材各200 g，按上述方法制備，分別得到干粉11.8 g(出膏率5.90%)、16.4 g(出膏率8.20%)和17.9 g(8.95%)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的備用。

2.2 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)菌 細(xì)菌菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃孵育24 h使菌株復(fù)蘇，然后接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃孵育18 h，然后取其中500 μL至4.5 mL培養(yǎng)基中，37 ℃孵育6 h，取出后按上一步操作重復(fù)稀釋兩次，得到1∶1000的稀釋菌液備用。采用96孔板連續(xù)稀釋法進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定，于96孔板加入100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；向第一孔加入100 μL樣品，與培養(yǎng)基混勻后吸取100 μL加入第2孔，以此類(lèi)推加至第10孔，吸取其中100 μL棄置廢液75%乙醇中；向第11孔再加入100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；除第12孔外，向每孔中加入100 μL實(shí)驗(yàn)用菌液混勻，以上過(guò)程為無(wú)菌操作。第n孔對(duì)應(yīng)藥液濃度為C0/2n+1(C0為初始質(zhì)量濃度48 mg·mL-1)，其中第11孔作為藥液空白，第12孔作為菌液空白，每種樣品平行3次。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果，以澄清孔的最小稀釋濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。采用瓊脂板劃分區(qū)域法進(jìn)行最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定，將上述無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)澄清孔內(nèi)的各菌藥混合液接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥液濃度即為最低殺菌濃度(MBC)。

2.2.2 真菌 將沙氏培養(yǎng)基斜面孵育3周左右的菌種，用接種鉤挑取適量菌落(約1×1 mm)放入消毒乳缽中，加入0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，研磨成真菌混懸液，再在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上用0.9%氯化鈉溶液調(diào)整菌液濃度到105～106·mL-1，備用。分別稱(chēng)取總提取物和3個(gè)單味藥5.0 g，加入100 mL滅菌培養(yǎng)液，即得50 mg·mL-1的藥液，依次分別稀釋至質(zhì)量濃度為25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 mg·mL-1，共6個(gè)藥物濃度梯度。將沙氏培養(yǎng)基分裝試管，每支試管1.7 mL，在121 ℃、0.15 MPa條件下滅菌15 min。當(dāng)滅菌培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時(shí)，在無(wú)菌條件下分別取總提取物和3個(gè)單味藥各濃度梯度的稀釋液0.3 mL，按濃度由低到高依次加入培養(yǎng)基，混勻制成斜面，使每管終體積為2 mL。陰性對(duì)照管為不加藥物的沙氏培養(yǎng)基2 mL。對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管每管均用劃線法接種，接種后置28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每日觀察1次，在培養(yǎng)過(guò)程中由2人在自然光線下通過(guò)肉眼判讀。7 d后判讀結(jié)果，以無(wú)真菌生長(zhǎng)試管內(nèi)藥物的最低濃度為該真菌的最低抑菌濃度(MIC)。在無(wú)菌條件下，將于121 ℃、0.15 MPa條件下滅菌20 min的沙氏液基3 mL，分別倒入上述抑菌實(shí)驗(yàn)中試管內(nèi)無(wú)真菌生長(zhǎng)的含藥培養(yǎng)基試管，用接種環(huán)輕刮取培養(yǎng)基表面，充分振蕩后倒入無(wú)菌試管中。將含藥的沙氏培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 d，每日觀察1次，觀察真菌菌落生長(zhǎng)情況。12 d后判讀結(jié)果，以無(wú)真菌菌落生長(zhǎng)的最低藥液濃度為最低殺菌濃度(MBC)。

2.3 體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)的分組及給藥方法

取ICR小鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為17組，每組10只小鼠，即空白組，模型組(福氏痢疾桿菌組、綠膿桿菌組和大腸桿菌組)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿莫西林膠囊200.0 mg·kg-1)，炎寧糖漿總提取物高劑量組(300.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥6.0 g·kg-1)，炎寧糖漿總提取物中劑量組(150.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥3.0 g·kg-1)、炎寧糖漿總提取物低劑量組(75.0 mg·kg-1，相當(dāng)于炎寧生藥1.5 g·kg-1)，鹿茸草高劑量組(300.0 mg·kg-1，相當(dāng)于鹿茸草生藥6.0 g·kg-1)、鹿茸草中劑量組(150.0 mg·kg-1，相當(dāng)于鹿茸草生藥3.0 g·kg-1)、鹿茸草低劑量組(75.0 mg·kg-1，相當(dāng)于鹿茸草生藥1.5 g·kg-1)，白花蛇舌草高劑量組(300.0 mg·kg-1，相當(dāng)于白花蛇舌草生藥6.0 g·kg-1)、白花蛇舌草中劑量組(150.0 mg·kg-1，相當(dāng)于白花蛇舌草生藥3.0 g·kg-1)、白花蛇舌草低劑量組(75.0 mg·kg-1，相當(dāng)于白花蛇舌草生藥1.5 g·kg-1)，鴨跖草高劑量組(300.0 mg·kg-1，相當(dāng)于鴨跖草生藥6.0 g·kg-1)、鴨跖草中劑量組(150.0 mg·kg-1，相當(dāng)于鴨跖草生藥3.0 g·kg-1)、鴨跖草低劑量組(75.0 mg·kg-1，相當(dāng)于鴨跖草生藥1.5 g·kg-1)。

2.4 體內(nèi)感染菌液的配制

將福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌3種菌株分別接種于液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，其濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葘?duì)，得1.5×108CFU·mL-1的菌液。37 ℃培養(yǎng)18 h后，用0.9%氯化鈉溶液稀釋為10-1、10-2、10-3……不同濃度菌液。再吸取不同濃度的菌液1 mL分別放于滅菌試管內(nèi)，分別加入5%干酵母0.9%氯化鈉溶液混懸液9 mL，即做成濃度為10-2、10-3……的細(xì)菌懸液備用。

2.5 體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)

將不同質(zhì)量濃度的菌懸液分別腹腔注射于體質(zhì)量約20 g的小鼠，每濃度組6只，每只0.5 mL，觀察動(dòng)物在3 d內(nèi)的死亡情況，選用引起小鼠80%～100%死亡的最小致死菌量即MLD進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)得福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌的MLD值分別為1.0×108、1.8×107、2.8×106CFU·mL-1。吸取含福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌的MLD菌液，分別腹腔注射各組小鼠體內(nèi)，每只0.5 mL，給藥組及陽(yáng)性對(duì)照組于感染前1天以及感染后1、6、12 h灌胃給藥，空白組給水，觀察并統(tǒng)計(jì)24 h內(nèi)各組動(dòng)物死亡率。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

死亡數(shù)據(jù)為分類(lèi)資料，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料與只數(shù)(n)，死亡率用百分?jǐn)?shù)(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各樣本對(duì)12種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的MIC結(jié)果

由表1所示，炎寧糖漿總提取物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、福氏痢疾桿菌、志賀氏菌、綠膿桿菌均有一定的抑菌作用，其中對(duì)福氏痢疾桿菌及綠膿桿菌的抑菌效果最佳，最低殺菌濃度均為0.375 mg·mL-1。3種單味藥中，鹿茸草和鴨跖草均能抑制大腸桿菌、福氏痢疾桿菌、志賀氏菌和綠膿桿菌。此外，鹿茸草還對(duì)沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出抑菌作用。白花蛇舌草未表現(xiàn)出任何抑菌作用。綜上所知，炎寧糖漿總提取物具有較好的抑菌作用，在配方中主要起抑菌作用的單味藥為鹿茸草和鴨跖草，且鹿茸草好于鴨跖草。

3.2 各樣本對(duì)12種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的MBC結(jié)果

由表2所示，炎寧糖漿總提取物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、福氏痢疾桿菌、志賀氏菌、綠膿桿菌均有一定的殺菌作用，其中對(duì)福氏痢疾桿菌、志賀氏菌和綠膿桿菌殺菌效果最佳，最低殺菌濃度均為1.5 mg·mL-1。鹿茸草和鴨跖草同樣表現(xiàn)出殺死大腸桿菌、福氏痢疾桿菌、志賀氏菌和綠膿桿菌的作用，鹿茸草還對(duì)沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出殺菌作用，白花蛇舌草未表現(xiàn)出任何殺菌作用。綜上所知，炎寧糖漿總提取物具有較好的殺菌作用，在配方中主要起到殺菌作用的單味藥為鹿茸草和鴨跖草，鹿茸草好于鴨跖草。此結(jié)果與上述的MIC結(jié)果基本一致。

3.3 各樣本對(duì)4種實(shí)驗(yàn)真菌的MIC結(jié)果

表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，炎寧糖漿總提取物質(zhì)量濃度在12.5、25 mg·mL-1時(shí)，分別對(duì)白色念珠菌和皮炎芽生菌表現(xiàn)出一定的抑制效果，但對(duì)曲霉菌和球孢子菌則無(wú)明顯作用。單味藥中鹿茸草和鴨跖草分別在濃度為12.5、25 mg·mL-1時(shí)對(duì)白色念珠菌表現(xiàn)出抑制作用。此外，鹿茸草還對(duì)皮炎芽生菌具有抑制作用，白花蛇舌草未表現(xiàn)出活性。此結(jié)果說(shuō)明，炎寧糖漿總提取物具有抑制真菌活性的作用，在配方中主要起到抑制真菌活性的單味藥為鹿茸草和鴨跖草。

注：+表示有少量細(xì)菌生長(zhǎng)，++表示有較多細(xì)菌生長(zhǎng)，下同。

表2 炎寧糖漿總提取物及3個(gè)單味藥對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的 MBC(n=3) mg·mL-1

表3炎寧糖漿總提取物及3個(gè)單味藥對(duì)4種
真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC(n=3) mg·mL-1

3.4 各樣本對(duì)4種實(shí)驗(yàn)真菌的MBC結(jié)果

表4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在4種真菌的MIC實(shí)驗(yàn)后，繼續(xù)經(jīng)過(guò)12 h的培養(yǎng)，總提取物和鹿茸草質(zhì)量濃度在25 mg·mL-1時(shí)對(duì)白色念珠菌表現(xiàn)出明顯的殺滅作用；鴨跖草和白花蛇舌草未表現(xiàn)出活性。此結(jié)果表明，總提取物表現(xiàn)出的殺真菌作用主要是鹿茸草起到的作用。

表4炎寧糖漿總提取物及3個(gè)單味藥對(duì)4種真菌
標(biāo)準(zhǔn)菌株的MBC(n=3) mg·mL-1

3.5 各樣本體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，對(duì)于福氏痢疾桿菌感染的小鼠，給藥24 h后模型組小鼠的死亡率為100%，炎寧糖漿總提取物高、中和低劑量組的死亡率分別為40%、40%和50%，與模型組相比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同樣，炎寧糖漿總提取物高和中劑量組對(duì)綠膿桿菌導(dǎo)致的小鼠全身感染模型具有保護(hù)作用，死亡率分別為50%和40%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，低劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，炎寧糖漿總提取物高、中和低劑量組對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的全身感染模型均表現(xiàn)出保護(hù)作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠存活率為100%，與模型組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，炎寧糖漿總提取物高、中和低劑量組對(duì)3種細(xì)菌導(dǎo)致的小鼠全身感染模型具有一定的保護(hù)作用。

表6實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種細(xì)菌感染小鼠24 h后，其死亡率均為100%。對(duì)于福氏痢疾桿菌感染的小鼠，鹿茸草高、中和低劑量組的死亡率分別為20%、20%和40%，與模型組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。鹿茸草高、中和低劑量組對(duì)于綠膿桿菌和大腸桿菌導(dǎo)致的小鼠全身感染模型同樣具有保護(hù)作用，死亡率分別為20%、40%和50%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠存活率為100%，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，鹿茸草高、中和低劑量組對(duì)3種細(xì)菌導(dǎo)致的小鼠全身感染模型都具有保護(hù)作用。

表7實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白花蛇舌草僅高劑量組表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的小鼠全身感染具有保護(hù)作用(P<0.05)，其余各組均無(wú)作用。陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠存活率為100%，與模型組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，白花蛇舌草對(duì)3種細(xì)菌導(dǎo)致的小鼠全身感染模型基本未表現(xiàn)出活性，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

表8結(jié)果顯示，小鼠被3種細(xì)菌感染24 h后，其死亡率均為100%，而陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠存活率為100%。對(duì)于福氏痢疾桿菌感染的小鼠，鴨跖草高、中劑量組的死亡率均為50%，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，低劑量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，鴨跖草高和中劑量組對(duì)綠膿桿菌導(dǎo)致的小鼠全身感染模型具有保護(hù)作用，死亡率分別為30%和40%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。此外，鴨跖草高、中劑量組對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo)的全身感染模型均表現(xiàn)出保護(hù)作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，鴨跖草高、中劑量組對(duì)3種細(xì)菌導(dǎo)致的小鼠全身感染模型具有一定的保護(hù)作用。

表5炎寧糖漿總提取物對(duì)福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)作用(n=10)

組別劑量/mg·kg-1n/只福氏痢疾桿菌綠膿桿菌大腸桿菌死亡數(shù)/只死亡率(%)死亡數(shù)/只死亡率(%)死亡數(shù)/只死亡率(%)模型組10101001010010100阿莫西林組200.01000**00**00**總提取物高劑量組300.010440*550*220**總提取物中劑量組150.010440*440*440*總提取物低劑量組75.010550*770440*

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表6鹿茸草對(duì)福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)作用(n=10)

組別劑量/mg·kg-1n/只福氏痢疾桿菌綠膿桿菌大腸桿菌死亡數(shù)/只死亡率(%)死亡數(shù)/只死亡率(%)死亡數(shù)/只死亡率(%)模型組—10101001010010100阿莫西林組200.01000**00**00**鹿茸草高劑量組300.010220**220**220**鹿茸草中劑量組150.010220**440*440*鹿茸草低劑量組75.010440*550*550*

表7白花蛇舌草對(duì)福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)作用(n=10)

組別劑量/mg·kg-1n/只福氏痢疾桿菌綠膿桿菌大腸桿菌死亡數(shù)/只死亡率(%)死亡數(shù)/只死亡率(%)死亡數(shù)/只死亡率(%)模型組—10101001010010100阿莫西林組200.01000**00**00**白花蛇舌草高劑量組300.010770880550*白花蛇舌草中劑量組150.010880100100990白花蛇舌草低劑量組75.0101010010010010100

表8鴨跖草對(duì)福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)作用(n=10)

組別劑量/mg·kg-1n/只福氏痢疾桿菌綠膿桿菌大腸桿菌死亡數(shù)/只死亡率(%)死亡數(shù)/只死亡率(%)死亡數(shù)/只死亡率(%)模型組—10101001010010100阿莫西林組200.01000**00**00**鴨跖草高劑量組300.010550*330**440*鴨跖草中劑量組150.010550*440*440*鴨跖草低劑量組75.010880770660

4 討論

現(xiàn)代研究顯示，許多中藥具有抗菌活性，能夠有效抑制及殺滅細(xì)菌和真菌。中藥的抗菌活性成分復(fù)雜，主要包括生物堿、黃酮、有機(jī)酸、萜類(lèi)、多糖、蒽醌類(lèi)等[3-4]。中藥抗菌藥在臨床應(yīng)用時(shí)多采取單味用藥形式，但隨著細(xì)菌的種類(lèi)不斷增多，耐藥性增強(qiáng)等多種問(wèn)題出現(xiàn)，聯(lián)合用藥以及在中藥范圍內(nèi)尋找有針對(duì)性療效的抗菌消炎藥也成為中醫(yī)藥工作者積極探尋的方向。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，多導(dǎo)致內(nèi)源性感染，以泌尿系感染為主，如尿道炎、膀胱炎、腎盂腎炎，也可引起腹膜炎、膽囊炎、闌尾炎等。大腸桿菌侵入血液，可引起敗血癥，尤其是早產(chǎn)兒或生后30 d內(nèi)的新生兒，并易患化膿性腦膜炎[5]。此外，某些血清型大腸桿菌能引起人類(lèi)急性腹瀉。福氏痢疾桿菌、志賀氏菌為革蘭氏陰性菌，主要可引起急、慢細(xì)菌性痢疾[6]，包括典型菌痢、非典型菌痢和中毒性菌痢3種。綠膿桿菌是革蘭氏陰性桿菌感染中僅次于大腸桿菌、克雷伯菌的常見(jiàn)病原菌。臨床上常見(jiàn)的有皮膚和皮下組織感染，中耳炎、腦膜炎、呼吸道感染、尿道感染、敗血癥[7]等。沙門(mén)氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，可引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎。炎寧糖漿總提取物可對(duì)大腸桿菌、福氏痢疾桿菌、志賀氏菌、綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出抑菌及殺菌效果，可通過(guò)抑菌和殺菌作用，用于治療細(xì)菌感染所引起的尿路疾病、腸道疾病以及呼吸系統(tǒng)疾病。其中炎寧糖漿總提取物對(duì)于細(xì)菌的最低抑菌濃度為0.375 mg·mL-1，最低殺菌濃度為1.5 mg·mL-1；而對(duì)于真菌的最低抑菌濃度為12.5 mg·mL-1，最低殺菌濃度為25 mg·mL-1。此外，炎寧糖漿總提取物對(duì)福氏痢疾桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌3種細(xì)菌誘導(dǎo)的小鼠全身性感染所導(dǎo)致的死亡率具有明顯的抑制作用，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了炎寧糖漿總提取物具有良好的抗菌效果。前期文獻(xiàn)研究中發(fā)現(xiàn)關(guān)于白花蛇舌草抗菌的報(bào)道多集中于其有效部位的抗菌作用，如黃酮類(lèi)成分、有機(jī)酸類(lèi)及乙醇提取部位[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在炎寧糖漿規(guī)定的藥物濃度范圍內(nèi)白花蛇舌草提取物在體外無(wú)明顯的抗菌活性，其原因可能在于白花蛇舌草提取物的抗菌濃度達(dá)不到其有效部位的抑菌濃度。李濤等[10]研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白花蛇舌草乙醇提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.2%時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌和鐮刀菌的抑菌效果差異不明顯，基本不存在抑菌作用。體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)中白花蛇舌草高劑量組減少死亡率有明顯降低，呈統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其他劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。白花蛇舌草含有蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物以及甾醇成分，在眾多文獻(xiàn)中顯示有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和保肝等作用，推測(cè)可能由于白花蛇舌草能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性，從而起到免疫調(diào)節(jié)以及抗炎作用，但體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)中小鼠死亡率降低的原因還需要其他藥理實(shí)驗(yàn)在小鼠體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。在體內(nèi)外抗菌實(shí)驗(yàn)中，鹿茸草和鴨跖草都表現(xiàn)出很好的抗菌活性，其中鹿茸草中富含苯乙醇苷類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物等，苯乙醇苷類(lèi)化合物具有良好的抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)能起到中強(qiáng)度的抑制作用[11]。而鴨跖草中富含生物堿與黃酮類(lèi)化合物，萬(wàn)京華等[12]研究發(fā)現(xiàn)鴨跖草提取液對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌等8種細(xì)菌有很好的抑菌作用，與常用的化學(xué)防腐劑相比抑菌作用更強(qiáng)。苯乙醇苷類(lèi)成分及黃酮類(lèi)成分都可能是炎寧糖漿發(fā)揮抗菌活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

白色念珠菌可侵犯人體許多部位，可引起皮膚念珠菌病，好發(fā)于皮膚皺褶處(腑窩、腹股溝、乳房下、肛門(mén)周?chē)凹诇?、指間)，導(dǎo)致皮膚潮紅、潮濕、發(fā)亮，有時(shí)蓋上一層白色或呈破裂狀物，病變周?chē)行∷荩部苫加陴つつ钪榫?，以鵝口瘡、口角炎、陰道炎最常見(jiàn)，還可患于內(nèi)臟及中樞神經(jīng)念珠菌病，可由黏膜皮膚等處病菌播散引起，發(fā)生肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、腦炎等，偶爾也可發(fā)生敗血癥[13]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，炎寧糖漿總提取物在4種真菌體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)白色念珠菌具有抑菌和殺菌作用，其單味藥中鹿茸草也同樣表現(xiàn)出對(duì)白色念珠菌具有抑菌和殺菌作用。白色念珠菌一旦生成生物被，即對(duì)抗真菌藥和機(jī)體防御機(jī)能產(chǎn)生很強(qiáng)的抵抗力，病菌的黏附性和侵襲性增強(qiáng)，故推測(cè)炎寧糖漿總提取物及鹿茸草可能對(duì)白色念珠菌早期黏附和中期生物膜的形成有抑制作用。炎寧糖漿的應(yīng)用與研究不僅有助于認(rèn)清組方中單味藥的抗菌活性成分，更有助于指導(dǎo)臨床科學(xué)用藥，提高臨床療效，對(duì)進(jìn)一步闡明組方科學(xué)內(nèi)涵及充實(shí)中醫(yī)藥理論有重大意義。