梔子藥材道地性系統(tǒng)評價與分析△

劉方舟，楊陽，張一穎，王琳，李萌，李園白

(中國中醫(yī)科學院 中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700)

梔子GardeniajasminoidesEills是茜草科Rubiaceae梔子屬常綠灌木，又名山梔子、黃梔子、黃枝子等[1]。梔子為常用中藥，以干燥成熟果實入藥，廣泛分布于長江以南各省區(qū)，目前以江西、湖南兩省為主要種植區(qū)域[2]。梔子有效成分包括環(huán)烯醚萜苷類、藏紅花素類、三萜類及黃酮類、多糖、膽堿類化合物等[3]。

道地藥材是指來自特定產(chǎn)地、栽培規(guī)范、加工精細、貯藏合理、品質卓越、療效顯著的中藥材，是傳統(tǒng)中醫(yī)藥行業(yè)評價藥材質量的一項獨特判別標準，其來源具有強烈的地域性[4]。藥材的道地性判斷、醫(yī)學實踐經(jīng)驗源于中醫(yī)藥學，脫離中醫(yī)藥學理論基礎，道地藥材就如同無源之水，故中藥材的本草考證研究顯得尤為重要，可根據(jù)本草考證結果推斷藥材道地產(chǎn)區(qū)[5]。性狀特征作為道地藥材的傳統(tǒng)評價指標，可在一定程度上概括道地藥材外在特征[6]，但不能確切反映道地藥材的內(nèi)在品質，因此，對道地藥材特征化學成分以及有效成分的含量測定，成為當前道地藥材質量特征評價的主要方法[7]，眾多研究結果表明，道地藥材與非道地藥材的指標性成分含量有顯著性差異[8]。

1 方法與結果

1.1 梔子道地產(chǎn)區(qū)本草考證

考證古近代本草著作和主流醫(yī)學典籍，對梔子藥材歷代道地產(chǎn)區(qū)進行歸納研究，本草考證所涉古代地名參照《古今地方大辭典》、《中華人民共和國行政區(qū)劃表》等映射得到現(xiàn)代地名，對現(xiàn)代地名進行頻次統(tǒng)計，結合古籍原文相關描述推斷梔子道地產(chǎn)區(qū)。

梔子本草考證共涉獵秦朝、漢朝、南北朝、唐朝、宋朝、明朝相關古籍10本，包括：《神農(nóng)本草經(jīng)》、《名醫(yī)別錄》、《本草經(jīng)集注》、《千金翼方 藥出州土》、《新修本草》、《本草圖經(jīng)》、《本草品匯精要》、《本草原始》、《本草綱目》、《本草述》以及民國書籍《藥物出產(chǎn)辨》。摘錄出江陵府、臨江軍、清遠、翁源、南陽、西蜀州郡等15個古代產(chǎn)區(qū)，對應現(xiàn)代地名(省)7個，具體結果見表1?，F(xiàn)代產(chǎn)區(qū)頻次統(tǒng)計結果由高到低為河南省、四川省、江西省、湖北省和福建省，而近代民國時期多記載廣東省為梔子產(chǎn)區(qū)，具體結果見表2，結合古籍文獻相關文字描述推斷河南省南陽市、江西省樟樹市、湖北省江陵縣、福建省建甌市為梔子藥材的道地產(chǎn)區(qū)。

表1 梔子古近代產(chǎn)地本草考證結果對應現(xiàn)代產(chǎn)地列表 mg·g-1

續(xù)表1

1.2 梔子性狀特征

針對梔子藥材性狀特征制定專業(yè)檢索策略，在CNKI數(shù)據(jù)庫中檢索相關文獻，檢索式如下：

(SU=梔子+山梔+大山梔+黑梔子+黃梔子+支子+山枝+枝子+黃枝+炒梔子+焦梔子+梔子炭 AND TI=性狀+外觀+真?zhèn)?偽品+生藥+形狀+大小+氣味+味道+斷面特征+摻偽+摻假+真假+混淆品+混用品)OR((SU=金銀花 AND(SU=鑒定+鑒別 OR CLC=R282.5)AND SU=生藥+形狀+大小+氣味+味道+斷面特征))OR(SU=金銀花 AND KY=性狀+外觀+真?zhèn)?偽品+生藥+形狀+大小+氣味+味道+斷面特征+摻偽+摻假+真假+混淆品+混用品)NOT CLC=R284 NOT CLC=R285 NOT CLC=R285.5 NOT CLC=R285.6 NOT SU=基因 NOT SU=化學 NOT SU=成分 NOT SU=分子 NOT SU=DNA NOT SU=RNA NOT SU=注射液 NOT SU=滴丸 NOT SU=片 NOT SU=膠囊 NOT SU=高效液相 NOT SU=HPLC NOT SU=飲片 NOT SU=丸

共檢索到梔子性狀特征相關文獻106篇，優(yōu)選有效文獻86篇，對文獻中藥材產(chǎn)地、全植物形狀、全植物大小、全植物色澤、全植物氣味、全植物味道、用藥部位、果實形狀、果實大小、果實色澤、果實表面特征、果實氣味、果實味道、果實斷面特征、果皮/果肉/果核/種子特征等字段進行錄入加工，從中提煉歸納梔子道地藥材性狀特征如下：

①原植物：根呈圓錐形或圓柱形，略彎曲，有分枝，長短不等，直徑0.3～1.6 cm。表面灰黃色或棕黃色，有細長縱皺紋及圓點狀支根痕。外皮易脫落，呈不規(guī)則形。質柔韌，不易折斷。斷面不平坦，黃白色，纖維性強，氣微香，味苦；莖呈圓柱形，較粗，外皮多不脫落，直徑0.6～2.2 cm，常二叉分枝，表面灰黑色，節(jié)間較明顯，有殘存葉柄痕或支根痕及膜質托葉鞘。較易折斷，斷面不平坦，纖維性較強，黃綠色，氣清香，味苦；葉長橢圓形或長圓狀披針形，長5.6～8.5 cm，網(wǎng)狀脈，主脈明顯，全緣，革質，表面黃棕色，托葉鞘狀，膜質。氣稍淡，味微苦。②藥材：用藥部位為干燥果實，外觀呈橢圓形或長卵形，長1.4～2～3.5 cm，直徑1～1.5 cm，表面深紅色或紅黃色，有5～8條縱橫棱，頂端具殘留花萼，有非腺毛，多碎斷，另一端稍尖，有果柄痕，果皮薄而脆，內(nèi)表面呈紅黃色，有光澤，具2～3條突起的假隔膜，具密而細小的疣狀突起。氣微，味微酸而苦，折斷面鮮黃色，果皮薄而脆，有光澤，內(nèi)表面鮮黃色，有光澤，中間具2條假隔膜，種子多數(shù)，扁卵形，集成團，棕黃色，表面有細密小點。

1.3 梔子化學成分數(shù)據(jù)分析

針對梔子化學成分研究制定專業(yè)檢索策略，在CNKI數(shù)據(jù)庫中檢索相關文獻，檢索式如下：

(TI=梔子+山梔+大山梔+黑梔子+黃梔子+支子+山枝+枝子+黃枝+炒梔子+焦梔子+梔子炭OR KY=梔子+山梔+大山梔+黑梔子+黃梔子+支子+山枝+枝子+黃枝+炒梔子+焦梔子+梔子炭)AND(SU=化學+成分+HPLC+UPLC+GC+MS+高效液相+質譜+指紋圖譜+波譜解析+含量+提取物+揮發(fā)油+水提物+萃取+質譜聯(lián)用+超臨界萃取+薄層+比色+NMR+液質聯(lián)用+質量評價+質量標準 OR CLC=R284+R284.1+R284.2+R284.3)NOT CLC=R285 NOT CLC=R285.5 NOT CLC=R285.6 NOT SU=基因 NOT SU=分子 NOT SU=DNA NOT SU=RNA NOT SU=注射液 NOT SU=滴丸 NOT SU=片 NOT SU=膠囊 NOT SU=飲片 NOT SU=丸 NOT SU=口服液 NOT SU=軟膏

共檢索到梔子化學成分相關文獻1461篇，從中優(yōu)選出101篇含量測定方法標準、成分全面、數(shù)據(jù)相對規(guī)范的有效文獻，整合文獻中梔子成分含量數(shù)據(jù)，共提煉出安徽、福建、廣西、湖北、河南、湖南、江蘇、江西、四川、浙江10個不同產(chǎn)地梔子的10個化學成分含量結果，涉及成分包括雞矢藤次苷甲酯(scandoside methyl ester)、京尼平苷酸(geriposidic acid)、京尼平龍膽二糖苷(genipin-1-β-D-gentiobioside)、去乙酰車葉草甘酸甲酯(methyl deacetyl asperulosidate)、山梔苷(shanzhiside)、梔子新苷/梔子酮苷(gardoside)、梔子苷/京尼平苷(geniposide)、羥異/羥基梔子苷(gardenoside)、西紅花苷-1(crocin-1)、西紅花苷-2(crocin-2)，10個不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材的10種成分含量平均值見表3。對數(shù)據(jù)進行全面清洗及規(guī)范化處理，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析、主成分分析和聚類分析，對梔子化學成分含量數(shù)據(jù)進行多指標綜合評價。

表3 不同產(chǎn)地梔子化學成分平均值 mg·g-1

1.3.1 數(shù)據(jù)清洗與標準化處理 不同來源數(shù)據(jù)規(guī)范單位為mg·g-1，將產(chǎn)地統(tǒng)一規(guī)范到“省”級行政單位，用SPSS處理極端值與錯誤值，用Analyze-DescriptiveStatistics-Descriptives-Savestandardizedvalvesasvariables方法對不同量綱數(shù)據(jù)進行標準化處理，標準化描述性分析結果見表4。

文獻中梔子苷的中英文對照存在混淆，梔子苷、京尼平苷、羥基梔子苷、羥異梔子苷等名稱存在普遍混用情況，梔子酮苷和梔子新苷對應同一英文名稱gardoside，甚至同一物質在一篇文章中出現(xiàn)兩個完全不同的名稱。針對這種情況，本研究通過分析文章中化合物英文名稱，到Molbase查詢得到化合物CAS號，相同CAS號代表同一物質，據(jù)此對數(shù)據(jù)進行標準化整合。梔子中各化合物中英文名稱及CAS號對照情況見表5。

表4 SPSS數(shù)據(jù)標準化處理描述性統(tǒng)計資料

表5 梔子中各化合物中英文名稱及CAS號對照表

1.3.2 單因素方差分析 本研究對10個不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材的10種化學成分含量數(shù)據(jù)進行多指標兩兩比較，經(jīng)清洗及規(guī)范化處理后數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析。分析結果見表6。

結果顯示，對于雞矢藤次苷甲酯、京尼平苷酸、京尼平龍膽二糖苷3個指標，河南、四川、江西產(chǎn)區(qū)梔子樣品指標值大都顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，指標正值結果與其他產(chǎn)區(qū)有顯著性差異(P<0.05)；對于去乙酰車葉草甘酸甲酯，各產(chǎn)區(qū)指標值間無顯著性差異(P>0.05)，觀察指標數(shù)值趨勢，湖北、河南、福建及江西產(chǎn)區(qū)指標值較高，與其他產(chǎn)區(qū)樣品有一定差異；對于山梔苷、梔子新苷/梔子酮苷、羥異/羥基梔子苷3個指標，江西、安徽、四川產(chǎn)區(qū)樣品指標值大都顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，指標正值結果與其他產(chǎn)區(qū)有顯著性差異(P<0.05)；對于梔子苷/京尼平苷，江西、河南、湖北產(chǎn)區(qū)梔子樣品指標值大都顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，指標正值結果與其他產(chǎn)區(qū)有顯著性差異(P<0.05)；對于西紅花苷-1、西紅花苷-2這兩個指標，則主要是浙江、江西產(chǎn)區(qū)指標正值與其他產(chǎn)區(qū)有顯著性差異(P<0.05)。

綜上，江西產(chǎn)區(qū)梔子樣品差異最大，除去乙酰車葉草甘酸甲酯成分外，其余各指標值均明顯高于其它產(chǎn)區(qū)，具顯著性差異(P<0.05)；河南、四川產(chǎn)區(qū)樣品差異也較大，多項指標與其它產(chǎn)區(qū)比較具顯著性差異；另外，浙江產(chǎn)區(qū)對于指標西紅花苷-1、西紅花苷-2與其它產(chǎn)區(qū)比較，有顯著性差異，此2成分屬藏紅花素類化合物，據(jù)此推斷，浙江產(chǎn)區(qū)梔子藥材可能含有較高含量的藏紅花素類化合物。

表6 不同產(chǎn)地梔子多指標兩兩比較

續(xù)表6

續(xù)表6

注：*P<0.05。

圖1 各產(chǎn)區(qū)京尼平苷酸平均值

圖2 各產(chǎn)區(qū)梔子苷/京尼平苷平均值

1.3.3 主成分分析 采用SPSS 22.0軟件對梔子藥材中雞矢藤次苷甲酯、京尼平苷酸、京尼平龍膽二糖苷、去乙酰車葉草甘酸甲酯、山梔苷、梔子新苷/梔子酮苷、梔子苷/京尼平苷、羥異/羥基梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2這10個檢測指標進行主成分分析[9]，以特征根>1，為提取標準，得到4個主成分，累積貢獻率64.181%，詳見表7及表8。

圖4 各產(chǎn)區(qū)西紅花苷-1平均值

表7 主成分初始特征值及貢獻率

表8 主成分荷載矩陣

圖5 主成分荷載圖

根據(jù)主成分荷載值，得到各主成分線性模型組合表達式：

F1=-0.172×1-0.034×2+0.019×3-0.036×4+0.387×5+0.396×6+0.164×7+0.181×8+0.201×9+0.199×10

(1)

F2=0.408×1+0.59×2+0.005×3+0.017×4+0.078×5-0.067×6-0.028×7-0.053×8-0.048×9+0.355×10

(2)

F3=0.378×1-0.026×2+0.511×3-0.055×4-0.211×5-0.021×6+0.105×7+0.316×8+0.073×9-0.389×10

(3)

F4=0.029×1+0.049×2+0.026×3+0.744×4+0.105×5-0.083×6+0.42×7-0.326×8+0.003×9-0.159×10

(4)

利用4個主成分方差貢獻率線性加權求和得到梔子藥材各產(chǎn)區(qū)質量的綜合得分評價函數(shù)：

F=(22.63×F1+15.383×F2+14.735×F3+11.433×F4)/64.181

(5)

綜合評價指數(shù)F數(shù)值越高，表示藥材質量越好。江西產(chǎn)區(qū)梔子整體評分最高，質量最好，河南和四川產(chǎn)區(qū)梔子評分較好，水平尚佳，其余產(chǎn)區(qū)梔子評分較低，水平一般。

1.3.4 聚類分析 采用SPSS 22.0軟件對梔子藥材中雞矢藤次苷甲酯、京尼平苷酸、京尼平龍膽二糖苷、去乙酰車葉草甘酸甲酯、山梔苷、梔子新苷/梔子酮苷、梔子苷/京尼平苷、羥異/羥基梔子苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2這10個檢測指標的平均值進行聚類分析。選擇Ward’s method作為聚類方法，樣品間距離的計算采用歐式距離平方(Squareded Euclidean distance)法，聚類結果見圖6。

圖6 各產(chǎn)區(qū)指標平均值聚類分析圖

結果如圖6所示，當閾值介于5～10時，10個產(chǎn)區(qū)梔子樣品可劃分為3大類，說明不同產(chǎn)區(qū)梔子藥材質量存在差異。第一大類包括江西、河南、湖北、福建4個產(chǎn)區(qū)，綜合參考表3中各產(chǎn)區(qū)指標含量的平均值來看，該大類各指標值均較高；第二大類包括湖南、浙江、廣西、西川、安徽，各指標值大都處于中等水平；第三大類為江蘇，該產(chǎn)區(qū)各指標值普遍較低。

2 討論

道地性是評價中藥品質優(yōu)劣的傳統(tǒng)理論和方法，是中醫(yī)藥學經(jīng)驗的科學總結，也是中醫(yī)理論在長久實踐過程中提煉出來的對中藥質量控制的客觀評價標準[10]。道地藥材存在其化學成分物質基礎特性[11]，具體表現(xiàn)為活性成分的含量差異。采用系統(tǒng)、科學的理論體系和方法來揭示藥材道地性的科學內(nèi)涵、探索道地性物質基礎的形成機理是道地藥材研究的關鍵[12]。

中藥材化學組成復雜、成分眾多，藥效的發(fā)揮往往不取決于單一成分，而是多成分間協(xié)作的結果[13]，因此，在研究中需要收集大量數(shù)據(jù)與信息[14]。針對某藥材品種僅采納單一文獻研究得到的一種或幾種成分含量測定指標進行分析的質量評價方法具有較大的局限性，缺乏系統(tǒng)性與全面性。理論上綜合分析的成分越多，越接近藥材化學成分的整體組成，評價結果就越全面、準確。為了將隱沒在大規(guī)模實驗數(shù)據(jù)中重要信息集中提煉出來，避免對梔子藥材道地性質量研究的片面性，本研究整合以往研究成果，從1461篇梔子化學相關文獻中優(yōu)選出101篇含量測定方法標準、成分全面、數(shù)據(jù)相對規(guī)范的有效文獻，整合有效文獻中梔子成分含量數(shù)據(jù)[15]，并對數(shù)據(jù)進行全面清洗及規(guī)范化處理，采用單因素方差分析、主成分分析和聚類分析方法對梔子化學成分含量數(shù)據(jù)進行多指標綜合評價，綜合評價結果顯示江西為梔子最優(yōu)產(chǎn)區(qū)，河南、湖北、福建、四川次之，其余產(chǎn)區(qū)梔子質量不佳。該結果與本草考證所得梔子道地產(chǎn)區(qū)頗為一致，為梔子藥材道地性評價提供有利支撐。

關于異源數(shù)據(jù)標準化處理與整合問題，筆者整理數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)文獻中梔子苷的中英文對照存在混淆，梔子苷、京尼平苷、羥基梔子苷、羥異梔子苷等名稱存在普遍混用情況，這種對結構相似化合物、或不同英文名稱卻譯為相同中文名稱的狀況，使得梔子苷等化合物在現(xiàn)代中藥學研究[16]、分析檢測方法、成分含量分析等方面出現(xiàn)混淆，對研究者造成相當程度上的誤導，尤其針對研究較廣泛的中藥成分，此種混亂將給研究者帶來更大的困擾[17]。針對這種情況，本研究通過分析文章中化合物對應的英文名稱，并到Molbase查詢得到化合物CAS號，一種成分具有唯一的CAS號，據(jù)此原則整理得到梔子中各化合物中英文名稱及CAS號對照表，根據(jù)對照表對各產(chǎn)區(qū)梔子成分含量數(shù)據(jù)進行標準化整合，確保了本研究結果的準確性與科學嚴謹性。