基于線粒體12S基因全序列分析我國綿羊癢螨(兔亞種)的遺傳多樣性

李燕方，古 江，袁 媛，謝 躍，賴為民，楊光友，古小彬

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130)

中國是養(yǎng)兔大國，每年的兔肉、兔毛和兔皮產(chǎn)量均居世界前茅[1-2]。癢螨病是危害養(yǎng)兔業(yè)的一種常見外寄生蟲病，我國家兔的感染率可達70%左右，該病是由綿羊癢螨(兔亞種)(Psoroptesovisvar.cuniculi)寄生于兔的外耳道所引起的一種以耳道內(nèi)形成卷紙樣結(jié)痂、瘙癢、病變部皮膚增厚為臨床特征，如不及時治療，甚至可引起死亡，每年給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[3-5]。

微進化(又名內(nèi)進化，microevolution)指種內(nèi)或近源物種間的進化，是生物多樣性源頭和適應環(huán)境的基礎(chǔ)。寄生蟲的微進化可受其本身的生物學特性、宿主的種類和分布、所生活環(huán)境變化等因素的影響，且寄生蟲的微進化對寄生蟲種群的遺傳多樣性有重要意義[6-7]。通過研究遺傳多樣性可分析物種的進化潛力及應對復雜環(huán)境的能力及歷史發(fā)展動態(tài)，推測未來發(fā)展趨勢[8]。我國家兔飼養(yǎng)區(qū)域廣泛，飼養(yǎng)家兔品種較多，且各飼養(yǎng)區(qū)處于不同的地理環(huán)境和溫度帶，這些因素對兔體表寄生的癢螨的影響尚不明確。因此，筆者采集我國5個區(qū)域的獺兔和肉兔源的癢螨蟲株，選用線粒體12S基因為目的片段，分析不同區(qū)域來源和不同兔品種來源的癢螨線粒體12S基因的差異，從而探討我國綿羊癢螨(兔亞種)的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 綿羊癢螨(兔亞種)樣品的來源

1.1.1 樣品采集地點 從我國華北地區(qū)(河北)、華東地區(qū)(山東)、華中地區(qū)(湖北、河南)、西北地區(qū)(陜西)和西南地區(qū)(四川、云南)自然感染綿羊癢螨病的獺兔和肉兔耳部采集獲得89個癢螨蟲株(表1)。

表1我國綿羊癢螨(兔亞種)不同種群樣品采集情況表

Table1SamplingsitesofPsoroptesovisvar.cuniculipopulationsinChina

種群組Population group省份Province采樣點Sampling site樣本數(shù)/編號Sample size/No.兔種類Species溫度帶Temperature zone華東地區(qū)Huadong山東濟南10/HD1～HD10肉兔暖溫帶華中地區(qū)Huazhong湖北荊州3/HZ1～HZ3獺兔亞熱帶河南開封4/HZ4～HN7獺兔暖溫帶華北地區(qū)Huabei河北保定6/HB1～HB6獺兔暖溫帶西北地區(qū)Xibei陜西寶雞7/XB1～XB7獺兔暖溫帶西南地區(qū)Xinan四川成都10/XN1～XN10肉兔亞熱帶西昌16/XN11～XN26獺兔亞熱帶綿陽2/XN27～XN28肉兔亞熱帶德陽2/XN29～XN30獺兔亞熱帶眉山4/XN31～XN34肉兔亞熱帶資陽8/XN35～XN42肉兔亞熱帶雅安3/XN43～XN45肉兔亞熱帶都江堰7/XN46～XN52肉兔亞熱帶云南昆明7/XN53～XN59獺兔亞熱帶

1.1.2 癢螨的收集 將病兔耳部的痂皮用鑷子輕輕取出，放入潔凈的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，30 min后除去皮屑，收集蟲體，進行形態(tài)學鑒定[9]確認后-20 ℃保存。

1.2 引物的設(shè)計

根據(jù)GenBank綿羊癢螨(兔亞種)的線粒體基因組(GenBank No.:KJ957822)找到線粒體12S基因全序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計用于擴增12S全序列的特異性引物。引物序列如下，12S-F:5′-GCTTTGGGGGCTGTAGAATCAC-3′；12S-R:5′-CAAAAACCCTAAACAAGAGGCACC-3′。引物由上海生工生物科技公司合成。

1.3 單個蟲體DNA的提取

將保存于-20 ℃的綿羊癢螨取出，每個樣品挑出一只蟲體放入一個EP管中，用尖頭玻璃棒迅速研碎。然后采用OMEGA公司的Mollusc/Arthropod基因組DNA抽提試劑盒提取單個癢螨蟲體的基因組DNA，保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.4 PCR擴增及測序

25 μL的擴增體系包括PCR Mixture 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 4.0 μL，雙蒸水6.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，72 ℃ 延伸10 min。擴增結(jié)束將PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢查結(jié)果。將凝膠中條帶大小與預期相符的膠塊切割下來，移入1.5 mL滅菌離心管中，利用天根普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠回收。將膠回收產(chǎn)物連接入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選出陽性克隆，送上海生工生物科技公司進行正反向測序。

1.5 序列分析

1.5.1 遺傳多樣性分析 將測定的核酸序列運用DNAman 5.2對所測序列進行拼接、比對[10]，用DNAStar 5.1對測序成功序列進行剪切修飾[11]。通過MEGA5.1軟件計算平均核苷酸差異指數(shù)(average number of nucleotide difference，K)、核酸分歧度(nucleotide divergence，Dxy)、遺傳距離[12]。運用Dna SP 5.1軟件計算單倍型多樣性(haplotypes diversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)、單倍型數(shù)(number of haplotypes)[13]。采用Arlequin 3.1通過分子方差分析(AMOVA)計算各個種群間的遺傳差異指數(shù)(Fst)，基因流(Nm)通過Nm=1/4(1/Fst-1)計算獲得[14]。

1.5.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析 中性檢驗(neutrality tests)結(jié)果(Tajima’sDtest，F(xiàn)u’sFstest)由Arlequin 3.1軟件計算得到[14]，結(jié)合Dna SP 5.1軟件分析得到的錯配分布曲線[13]，以了解我國綿羊癢螨(兔亞種)的歷史動態(tài)。采用MEGA 5.1軟件構(gòu)建各種群間的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹[12]，并bootstraps 1 000次，檢驗聚類樹的置信度；同時結(jié)合Network 5.0制作單倍型網(wǎng)絡(luò)圖[15]。

2 結(jié) 果

2.1 癢螨12S基因全序列的堿基組成及變異

成功獲得了89個綿羊癢螨兔亞種樣品的12S序列(登錄號：MH361034～MH361122)，89條12S基因全序列長度均為657 bp，其中A、T、C、G平均含量為31.34%、40.03%、10.20%、18.43%，平均A+T含量71.37%，平均C+G含量28.63%，出現(xiàn)明顯的偏倚。89條12S基因序列共存在變異位點76個，其中多變異位點7個，單變異位點69個。

序列的突變方式大部分是堿基轉(zhuǎn)換(轉(zhuǎn)換/顛換= 6.9)，其中包括90個轉(zhuǎn)換(T?C，A?G)，13個 顛換(G?T，A?T，A?C，G→C)，并且沒有發(fā)現(xiàn)堿基的缺失。G→C顛換只存在于華中種群，華北種群和西北種群無顛換突變。所有種群中T?C轉(zhuǎn)換率比A?G轉(zhuǎn)換率高。

2.2 5個地理種群遺傳多樣性參數(shù)及中性檢驗值分析

用Dna SP 5.1軟件分析發(fā)現(xiàn)獲得的89條12S序列共檢測出50個單倍基因型(H1～H50)；其中，西南種群所含單倍型數(shù)最多(35個)，有32個特有單倍型(H19～H50)；其次為華東種群，所含單倍型數(shù)為8個，存在7個特有單倍型(H2～H8)；華中和華北種群所含單倍型數(shù)相同，均為6個，分別存在特有單倍型1個(H12)和4個(H13～H16)；以西北種群所含單倍型數(shù)最少(5個)，存在2個特有單倍型(H17、H18)(表2)。50個單倍型中存在4個共享單倍型(H1、H3、H9和H11)；其中H9和H11被西南與華中、華北、西北種群所共有，共享頻率最高，分別為19.10%(17/89)和14.61%(13/89)；H1被西南與華中、華東、西北種群共享，共享頻率為12.36%(11/89)；單倍型H3僅被華中和華東種群所共享，共享率2.25%(2/89)。

我國5大地區(qū)綿羊癢螨(兔亞種)種群的單倍型多樣性(Hd)較高，范圍為0.857 14(西北種群)～1.000 00 (華北種群)，我國整體種群單倍型多樣性(Hd)為0.931 05，表明我國種群單倍型多樣性較為豐富。5個地區(qū)種群中，華北種群的核苷酸多樣性(π)最低(0.003 55)，華東種群的核苷酸多樣性(π)最高(0.005 82)，中國整體核苷酸多樣性(π)為0.005 59 (表1)，表明中國綿羊癢螨種群核苷酸多樣性較高。我國5大地區(qū)種群的平均核苷酸差異指數(shù)(K)范圍為2.333 33(華北種群)～3.822 22(華東種群)。

利用Tajima’sD和Fu’sFs檢驗得到的中性檢測結(jié)果見表2。西南種群的Tajima’sD和Fu’sFs均呈負值，且在我國5個種群中絕對值最高(Tajima’sD=-2.406 94；Fu’sFs=-26.028 89)。華北種群與西南種群Fu’sFs為負值(-3.926 53和-26.028 89)，且差異極顯著，表明這兩個種群近期可能經(jīng)歷過群體擴張；但我國綿羊癢螨整體種群的Tajima’sD(-0.928 31)和Fu’sFs(-7.066 71)檢驗結(jié)果均為負值且不顯著，表明我國綿羊癢螨群體符合中性進化假說，雖然西南種群與華北種群近期有過群體擴張，但并未對我國整體綿羊癢螨種群的擴張有明顯的影響，從而我國整體種群呈現(xiàn)較為穩(wěn)定狀態(tài)。

2.3 遺傳距離、核酸分歧度及分子變異分析

從表3可見，我國綿羊癢螨的遺傳距離范圍值為0.003 97～0.006 54，其中華北地區(qū)與華東地區(qū)的遺傳距離最大(0.006 54)；華北地區(qū)與西北地區(qū)遺傳距離最小(0.003 97)。我國綿羊癢螨的核酸分歧度(Dxy)范圍為0.003 95～0.006 49，其中華北地區(qū)與華東地區(qū)、西北地區(qū)的核酸分歧度分別為0.006 49 和0.003 95。西南地區(qū)與其他4個地區(qū)相比，與西北地區(qū)之間的核酸分歧度(0.005 02)和遺傳距離(0.005 06)均最小。

我國各種群間的基因流(Nm)為0.724 32至無限大(∞)，遺傳分化指數(shù)(Fst)為-0.094 25～0.256 59(表4)，5個地區(qū)之間的基因交流情況有所不同。其中，西南與華中和西北種群之間的基因交流最為頻繁，從而降低了西南與華中、西北種群間的核酸分歧度。我國整體綿羊癢螨種群的Nm和Fst分別為5.657 372和0.042 322， 表明我國綿羊癢螨整體基因流水平較高，遺傳分化程度弱。分子方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種群內(nèi)和種群間的遺傳變異方差比率分別為95.77%和4.23%，表明本研究中綿羊癢螨的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)部。

表2綿羊癢螨(兔亞種)群體遺傳多樣性參數(shù)

Table2GeneticdiversityindexesofPsoroptesovisvar.cuniculi

種群編號Population樣品數(shù)量Number of isolates單倍型數(shù)(H)Number of haplotypes單倍型多樣性(Hd)Haplotype diversity核苷酸多樣性(π)Nucleotide diversity平均核苷酸差異指數(shù)(K)Average number of nucleotide differencesTajima’s DFu’s Fs華東(HD1～10)108 (H1～H8)0.933 330.005 823.822 22-0.765 54-2.767 17華中(HZ1～7)76 (H1、H3、H9～H12)0.952 380.005 513.619 05-0.078 74-1.808 29華北(HB1～6)66 (H9、H11、H13～H16)1.000 000.003 552.333 33-1.390 31??-3.926 53???西北(XB1～7)75 (H1、H9、H11、H17～H18)0.857 140.004 352.857 140.000 00-0.802 69西南(XN1～59)5935 (H1、H9、H11、H19～H50)0.924 610.005 683.732 90-2.406 94???-26.028 89???中國整體Total8950(H1～H50)0.931 050.005 593.673 65-0.928 31-7.066 71

*.P<0.05；**.P< 0.01；***.P<0.001

表3我國綿羊癢螨(兔亞種)各地理種群間的核酸分歧度(上三角)與遺傳距離(下三角)

Table3Pairwisecomparisonsofthenucleotidedivergence(abovediagonal)andgeneticdistance(belowdiagonal)betweengeographicalpopulationsofPsoroptesovisvar.cuniculi

種群Population華東HD華中HZ華北HB西北XB西南XN華東HD0.005 830.006 490.005 570.005 98華中HZ0.005 870.004 600.004 500.005 55華北HB0.006 540.004 630.003 950.005 63西北XB0.005 610.004 530.003 970.005 02西南XN0.006 020.005 590.005 670.005 06

表4不同綿羊癢螨(兔亞種)種群間的基因流(Nm)(上三角)和遺傳分化度(Fst)(下三角)

Table4Geneflow(Nm) (abovediagonal)andpopulationpairwisefixationindex(Fst)values(belowdiagonal)amongdifferentPsoroptesovisvar.cuniculipopulations

種群Population華東HD華中HZ華北HB西北XB西南XN華東HD9.054 270.724 322.908 076.106 34華中HZ0.026 87(0.290 91)28.035 00∞∞華北HB0.256 59(0.045 45)0.010 09(0.490 91)∞1.662 21西北XB0.079 16(0.263 64)-0.094 25(1.000 00)0.002 60(0.463 64)∞西南XN0.039 33(0.245 45)-0.009 98(0.554 55)0.133 54(0.763 64)-0.014 10(0.763 64)

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及種群整體遺傳結(jié)構(gòu)分析

以疥螨(Sarcoptesscabiei)的12S基因(GenBank No.: NC_031334)為外群，利用MEGA 5.1軟件采用NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，結(jié)果顯示綿羊癢螨5個地理種群的50個單倍型散在分布于不同的支系內(nèi)，如西南種群的35個單倍型散在于不同的分支(圖1),未按兔品種、溫度帶和地域來源的不同而聚類，而呈現(xiàn)為混雜的分布格局(圖1)。

為了確定單倍型的譜系關(guān)系，采用Network 5.0軟件以MJ(Median-Joining network)法構(gòu)建5個不同地理種的50個單倍型(包括共享單倍型和特有單倍型)的網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖具有豐富的分支和節(jié)點，以優(yōu)勢單倍型(H1、H9、H11)為中心呈輻射狀分布，缺失3個單倍型(圖2中紅色圓圈，分別用mv1～mv3表示)，且各單倍型的聚類情況與NJ樹類似，并未按兔品種、溫度帶和地域來源進行聚類。對我國綿羊癢螨世系進行群體歷史動態(tài)分析，核苷酸不配對分布呈雙峰型(圖3)，表明早前未曾發(fā)生過群體擴張，長期處于一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)。

3 討 論

寄生蟲種群遺傳多樣性會受地理環(huán)境[16]、寄生蟲生物學特性、與宿主間的互相適應等多種因素影響[17]。我國兔業(yè)養(yǎng)殖歷史悠久，家兔養(yǎng)殖分布于除西藏外的各省、市、自治區(qū)[1-2]，這些不同地理區(qū)域包含了山地、高原、丘陵、盆地、平原等形態(tài)，地勢地貌差異較大。這些差異較大地勢地貌對綿羊癢螨兔亞種種群是否存在較大影響尚不明確。目前，綿羊癢螨種群的遺傳多樣性研究較為缺乏，僅筆者課題組的趙習彬等[18]利用線粒體細胞色素氧化酶b(Cytb)基因全序列進行了相關(guān)研究，12S基因作為一種常見的分子標記，進化速度與mtDNA基因組的平均進化水平基本相同[19]，已廣泛用于研究動物寄生性蜱螨種群遺傳學[20-21]。目前，GenBank中除筆者課題組登陸的癢螨線粒體基因全序列中包含有12S序列信息外[22]，尚未見癢螨的其他12S序列，因此本研究基于我們測序得到的89條綿羊癢螨12S基因全序列探討我國綿羊癢螨兔亞種種群的遺傳變異，以期為進一步明確我國綿羊癢螨兔亞種的遺傳多樣性提供基礎(chǔ)。

H1～H50表示50個單倍型；XN、HD、HZ、HB、XB分別表示西南、華東、華中、華北、西北
H1-H50 represent 50 haplotypes; XN, HD, HZ, HB, XB, represent Xinan, Huadong, Huazhong, Huabei, Xibei
圖1 基于50個綿羊癢螨12S基因單倍型構(gòu)建的NJ樹
Fig.1 Neighbour-joining tree constructed from the 50 haplotypes of mtDNA 12S gene in Psoroptes ovis var. cuniculi based on Kimura-2-parameter distances

趙習彬等[18]基于Cytb全基因發(fā)現(xiàn)我國綿羊癢螨(兔亞種)種群中存在著豐富的核苷酸多樣性(0.012 0)和單倍型多樣性(0.959 2)，比筆者基于線粒體12S基因全序列得到的核苷酸多樣性(0.005 59)和單倍型多樣性(0.931 05)高，可能與Cytb基因(1 100 bp)全序列的長度大于12S基因全序列(657 bp)，其所含有的信息位點更多有一定的關(guān)系；綜合Cytb和12S基因的核苷酸多樣性和單倍型多樣性來看，兩者值均較高，表明我國綿羊癢螨(兔亞種)種群有較高的遺傳多樣性水平。我國癢螨種群呈現(xiàn)的這種較高水平的核苷酸多樣性和單倍型多樣性，將更利于癢螨在進化過程中通過產(chǎn)生多種變異來應對不良環(huán)境因素[23]，有史可尋中國地區(qū)發(fā)生過一些如旱災、雪災等災害，而這種遺傳變異可能在癢螨抵御這些不利環(huán)境因素中起到重要作用[24]。趙習彬等[18]和筆者本次研究的群體歷史動態(tài)分析結(jié)果均呈現(xiàn)我國綿羊癢螨種群整體的中性檢測Tajima’sD和Fu’sFs檢驗結(jié)果均為負值，且差異均不顯著，說明種群在歷史演變中積累較多基因變異[25]。結(jié)合錯配分布曲線(圖3)中出現(xiàn)的兩個峰值，表明綿羊癢螨種群在長期的歷史進化過程中一直處于一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)，種群早期可能并未經(jīng)歷過較大的群體擴張[26]，由此可見，即使個別種群(華北和西南)發(fā)生過群體擴張過程，使整體種群表現(xiàn)出較弱的突然增長，但并未影響到種群的整體穩(wěn)定，這與趙習彬等[18]的研究結(jié)果類似。

地理距離是影響種群間基因交流的重要因素之一[27]，但趙習彬等[18]和筆者的研究發(fā)現(xiàn)綿羊癢螨(兔亞種)各地理種群間的基因交流與地理距離的遠近并未全部表現(xiàn)出正相關(guān)的聯(lián)系，基于綿羊癢螨Cytb基因發(fā)現(xiàn)，山東和河北的地理距離最近(340 km)，但山東和河北兩地的綿羊癢螨種群間的遺傳距離不是最小的(0.001)；本次研究基于12S基因發(fā)現(xiàn)保定(華北種群代表)與寶雞(西北種群代表)間的地理距離比保定與濟南(華東種群)的距離遠，但華北、西北種群內(nèi)的基因交流值(趨于無窮大)卻大于華北、華東種群(0.724 32)。

圓圈的大小與單倍型的分布頻率成正比；不同顏色代表不同樣品來源
The circle sizes are proportional to the number ofisolates;Different colors represent different sample sources
圖2 基于50個綿羊癢螨12S基因單倍型單倍型構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖
Fig.2 Network of mtDNA 50 12S gene haplotypes in Psoroptes ovis var. cuniculi

圖3 基于12S gene序列分析我國89株綿羊癢螨(兔亞種)蟲株的錯配分布曲線
Fig.3 The mismatch-distribution of 89 Psoroptes ovis var. cuniculi isolates based on 12S gene sequence

由此可見，較遠的地理隔離不能阻礙綿羊癢螨種群間頻繁的基因交流，而這種基因交流單靠癢螨自身是不可能完成的，因為癢螨蟲體較小，大小約(0.3～0.9) mm ×(0.2～0.52) mm，其爬行能力較弱[9]，而不同地區(qū)間的兔貿(mào)易為各地癢螨種群間的基因交流提供了機會。然而，早期我國交通不便，較遠地區(qū)間的兔貿(mào)易較少，導致各地癢螨種群間的基因交流較少；自20世紀50年代以來，中國家兔飼養(yǎng)量急劇增加[1]，交通便捷，各地間的兔貿(mào)易日益頻繁，在一定程度上增加了各地的癢螨種群之間的基因交流。

Fst是衡量種群遺傳分化的指標，當0.00≤Fst< 0.05時，遺傳分化程度很弱；當0.05≤Fst<0.15 時遺傳分化程度中等； 0.15≤Fst≤0.25時遺傳分化程度較大[28]?；?2S基因分析得到的Fst值(Fst=0.042 322)發(fā)現(xiàn)我國的綿羊癢螨種群存在一定的遺傳分化，從而導致各地理種群間存在多個特有單倍型(46/50)；但綿羊癢螨種群分化程度較弱(Fst<0.05)，這與種群間頻繁的基因交流相關(guān)(Nm=5.657 372)；綿羊癢螨種群的這種遺傳分化可能是由地理環(huán)境差異、歷史自然災害、兔的品種等因素所造成的，但這種遺傳分化可能由于時間不夠尚未累積形成新的種群遺傳結(jié)構(gòu)，這點在NJ樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析中得到證實(圖1、圖2)。

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示出優(yōu)勢單倍型有3個(H9、H11、H1)(圖2)，有研究說明優(yōu)勢單倍型往往具有更加廣泛的地理分布[29-30]，筆者的研究亦證實了這點，其中優(yōu)勢單倍型H9、H11、H1廣泛分布在華東、華中、華北、西北、西南5個地區(qū)。另外單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)中不能直接看出單倍型之間的進化關(guān)系，但出現(xiàn)歷史單倍型的缺失(圖2中紅色圓圈，分別用mv1～mv3表示)，這可能是因為某些地區(qū)樣本數(shù)量太少，并且各單倍型的聚類情況與NJ樹類似(圖1)，總體上看，沒有明顯的地域性差別，也并未按兔品種、溫度帶進行劃分，這點聚類特點在趙習彬等[18]基于線粒體Cytb基因的研究中亦得到證實。

4 結(jié) 論

經(jīng)對華東、華中、華北、西北、西南5個地區(qū)綿羊癢螨線粒體12S基因進行分析，發(fā)現(xiàn)我國綿羊癢螨(兔亞種)單倍型多樣性高，核苷酸多樣性低，基因交流頻繁，未形成以兔品種、溫度帶和地域來源劃分的種群遺傳結(jié)構(gòu)。