釀酒酵母β-葡聚糖對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β-防御素-1表達(dá)的影響

張 曼，金 鑫，王云鶴，魏 方，溫婧怡，李政憶，楊銀鳳*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

防御素(defensins)是具有兩親性和陽(yáng)離子性質(zhì)的小半胱氨酸肽家族，被認(rèn)為是構(gòu)成最初和有效的宿主防御系統(tǒng)的一部分，其廣泛存在于植物、昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物中[1-2]。防御素基于半胱氨酸殘基之間分子內(nèi)二硫鍵形成的模式分為3類：α-、β-和θ-防御素[3]。β-防 御素是一種由38～42個(gè)氨基酸組成，且存在于許多脊椎動(dòng)物體內(nèi)的陽(yáng)離子抗菌肽[4]，其在先天和適應(yīng)性免疫方面起著關(guān)鍵作用，能夠殺死各種病原體，包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)。此外，β-防 御素還是免疫細(xì)胞的趨化性引誘劑，能夠參與免疫調(diào)節(jié)[5]。

β-葡聚糖是一種廣泛存在于細(xì)菌、真菌、藻類和植物細(xì)胞壁中的多糖，其因能夠增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、促進(jìn)傷口愈合以及刺激先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)而備受關(guān)注[6-8]。近年來(lái)一些研究表明，β-葡聚糖可以通過(guò)促進(jìn)人和魚(yú)類白細(xì)胞介素、防御素和cathelicidins的分泌，從而對(duì)侵入機(jī)體內(nèi)的微生物起到防御功能[9-13]。然而，關(guān)于釀酒酵母細(xì)胞壁成分β-葡聚糖對(duì)反芻動(dòng)物RECs防御素表達(dá)影響的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)采用qPCR和ELISA方法檢測(cè)β-葡聚糖在不同濃度、不同時(shí)間段刺激RECs后SBD-1 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。為今后了解β-葡聚糖與上皮細(xì)胞防御素表達(dá)的關(guān)系，解析防御素發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的途徑和機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自呼和浩特市北亞屠宰場(chǎng)健康狀況良好的綿羊。綿羊屠宰后立刻剪取一塊內(nèi)表面乳頭較大且較密的瘤胃組織，用生理鹽水沖洗干凈后放入PBS中備用。

1.2 綿羊RECs原代培養(yǎng)

根據(jù)金鑫等[14]報(bào)道的綿羊RECs培養(yǎng)方法進(jìn)行綿羊RECs的原代培養(yǎng)，鈍性分離瘤胃組織的漿膜和肌層，將分離后的黏膜層經(jīng)0.25% 胰蛋白酶在37 ℃溫箱消后化，將后4次收集得到的細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，過(guò)濾、離心、分裝，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中達(dá)到80%～100%傳代培養(yǎng)后，用不含有兩性霉素和其他抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基37 ℃，5% CO2孵育過(guò)夜，用于后續(xù)刺激試驗(yàn)。

1.3 β-葡聚糖刺激綿羊RECs的條件優(yōu)化

用不同濃度(0、5、10、20、50、100 μg·mL-1)的β-葡聚糖(Sigma-Aldrich)刺激RECs，37 ℃，5% CO2孵育8 h。然后通過(guò)qPCR和ELISA方法檢測(cè)SBD-1 mRNA和蛋白的表達(dá)量，以選取β-葡聚糖刺激SBD-1表達(dá)的最佳濃度；用最佳的β-葡聚糖濃度分別刺激RECs 0、2、4、8、12、24 h，然后通過(guò)qPCR和ELISA方法檢測(cè)SBD-1 mRNA和蛋白的表達(dá)量，以選取β-葡聚糖刺激SBD-1表達(dá)的最佳時(shí)間。

1.4 引物設(shè)計(jì)

本研究中β-actin為內(nèi)參基因，SBD-1為所要檢測(cè)的目的基因。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)和合成(表1)。

表1引物序列

Table1Primersequences

基因名稱Gene nameGenBank登錄號(hào)GenBank accession No.片段大小/bpFragment size引物序列(5′→3′)Primer pair sequenceβ-actinU39357208F: GTCACCAACTGGGACGACAR: AGGCGTACAGGGACAGCASBD-1U75250133F:GCTCTTCTTCGTGGTCCTGTR: ACAGGTGCCAATCTGTCTCA

1.5 綿羊RECs總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

綿羊RECs總RNA的提取按照RNA提取試劑盒(Axygen Scientific, Inc. USA)進(jìn)行操作，并使用Synergy H4 Hybrid酶標(biāo)儀(BioTek Inc，Winooski，VT，USA)測(cè)量260和280 nm處的吸光度來(lái)分析總RNA濃度和純度，將OD260 nm/OD280 nm比值在1.9～2.0范圍內(nèi)的樣品按照TaKaRa的去除基因組DNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將得到的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 綿羊SBD-1 mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

內(nèi)參基因β-actin和目的基因SBD-1的qPCR測(cè)定在QuantStudioTM7 Flex Real-time PCR System儀器(Thermo Fisher Scientific)上進(jìn)行。每20 μL 反應(yīng)物含有SYBR Premin Ex Taq(2×)10 μL，正向和反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)閿U(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，45個(gè)循環(huán)；熔解程序：95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，每個(gè)樣品分別做5個(gè)重復(fù)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 綿羊SBD-1蛋白的ELISA檢測(cè)

收集不同濃度的β-葡聚糖處理組以及同濃度刺激0、2、4、8、12和24 h后的共培養(yǎng)上清，采用綿羊防御素β1(DEFβ1)ELISA試劑盒，按其說(shuō)明進(jìn)行操作，然后用Synergy H4 Hybrid酶標(biāo)儀(BioTek Inc，Winooski，VT，USA)測(cè)定各樣品OD值(450 nm)，并運(yùn)用EXCEL(2007)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 綿羊RECs的活力鑒定

將RECs以2×104個(gè)·孔-1的密度接種在96孔板。用不同濃度(0、5、10、20、50和100 μg·mL-1)的β-葡聚糖(Sigma-Aldrich)刺激RECs 8 h，以及用誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)最高的β-葡聚糖濃度刺激瘤胃上皮0、2、4、8、12和24 h，同時(shí)單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對(duì)照。將100 μL DMEM/F12培養(yǎng)基和10 μL MTT(Sigma-Aldrich)加入到每個(gè)孔中，并在37 ℃，5% CO2孵育4 h后用DMSO溶解。使用酶標(biāo)儀在540 nm下測(cè)定孔的密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism5軟件繪制圖片。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way，ANOVA)，多重比較采用最小顯著性差異法(least-significant difference，LSD)。所有數(shù)據(jù)表示為至少5個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定在P< 0.05水平。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊RECs的傳代培養(yǎng)

綿羊RECs傳代細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)2 d后，細(xì)胞形態(tài)清晰，呈鵝卵石鋪路狀(圖1A)；培養(yǎng)4 d后，細(xì)胞即有90%以上聚集生長(zhǎng)，鏡下觀察基本沒(méi)有空余位置，形成漩渦狀排列的致密單層細(xì)胞集落，且細(xì)胞界限明顯，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖1B)。

2.2 綿羊qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物SBD-1的特異性檢測(cè)

以β-actin為內(nèi)參基因，SBD-1為目的基因，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA經(jīng)qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增曲線表明，擴(kuò)增效果良好(圖2A, 2B)，經(jīng)熔解曲線分析，β-actin和SBD-1分別在88.5和84 ℃出現(xiàn)單一峰，均沒(méi)有出現(xiàn)雜峰，并且主峰(熔解峰)對(duì)應(yīng)的Tm值與引物設(shè)計(jì)后預(yù)期產(chǎn)物Tm值相同(圖3A, 3B)，說(shuō)明qPCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的具有特異性的產(chǎn)物。

2.3 綿羊qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物SBD-1的瓊脂糖凝膠電泳分析

將qPCR擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，在約208和133 bp位置處可見(jiàn)各有一條特異性條帶，與引物設(shè)計(jì)預(yù)期的片段大小相一致，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶整齊且無(wú)二聚體形成，表明qPCR產(chǎn)物分別為β-actin和SBD-1的基因產(chǎn)物(圖4)。

A. 傳代培養(yǎng)2 d的綿羊RECs；B. 傳代培養(yǎng)4 d的綿羊RECs
A. The ovine ruminal epithelial cells after 2 days subculture； B. The ovine ruminal epithelial cells after 4 days subculture
圖1 綿羊RECs的傳代培養(yǎng)(100×)
Fig.1 Subcultures of ovine ruminal epithelial cells (100×)

A. β-actin基因的擴(kuò)增曲線；B. SBD-1基因的擴(kuò)增曲線
A. The amplification curve of β-actin gene； B. The amplification curve of SBD-1 gene
圖2 β-actin和SBD-1基因的擴(kuò)增曲線
Fig.2 The amplification curves of β-actin and SBD-1 genes

A. β-actin熔解曲線；B. SBD-1熔解曲線
A. The melt peak curve of β-actin gene; B. The melt peak curve of SBD-1 gene
圖3 β-actin和SBD-1的熔解曲線
Fig.3 The melt peak curves of β-actin and SBD-1 genes

圖4 β-actin和SBD-1基因qPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
Fig.4 The agarose gel electrophoresis of amplified products of β-actin and SBD-1 by qPCR

2.4 β-葡聚糖刺激綿羊RECs對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)的影響

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0分析，結(jié)果如圖5所示，用不同濃度的β-葡聚糖(5、10、20、50和100 μg·mL-1)刺激RECs 8 h后，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖能夠誘導(dǎo)SBD-1 mRNA的表達(dá)，且當(dāng)β-葡聚糖濃度為10 μg·mL-1時(shí)SBD-1的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而當(dāng)β-葡聚糖的濃度為100 μg·mL-1刺激

RECs時(shí)，發(fā)現(xiàn)SBD-1 mRNA的表達(dá)量顯著降低，但仍顯著高于空白對(duì)照組(P< 0.05，圖5A)。接下來(lái)用10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs 0、2、4、8、12和24 h后，與空白對(duì)照組相比，β-葡聚糖刺激2 h后觀察到SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最高(P<0.01， 圖5B)。 因此，當(dāng)濃度為10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs 2 h后SBD-1 mRNA的表達(dá)量達(dá)到最高。

A.β-葡聚糖不同刺激濃度對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)的影響；B. β-葡聚糖不同刺激時(shí)間對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)的影響。*. P<0.05；**. P<0.01，下圖同
A.Effects of different concentrations of β-glucan on SBD-1 mRNA expression; B. Effects of β-glucan stimulated RECs at different times on SBD-1 mRNA expression. *. P < 0.05; **. P < 0.01, the same as the following figures
圖5 β-葡聚糖對(duì)綿羊RECs SBD-1 mRNA表達(dá)的影響
Fig.5 Effect of β-glucan on the expression of sheep RECs SBD-1 mRNA

2.5 β-葡聚糖刺激綿羊RECs對(duì)SBD-1蛋白表達(dá)的影響

標(biāo)準(zhǔn)曲線的二次多項(xiàng)式擬合方程為y=ax2+bx+c(其中a=2 656.3，b=3 185.5，c=-249.72)，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3，表明樣品濃度可以利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算(圖6)。

圖6 ELISA試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.6 Standard curve of ELISA test

ELISA結(jié)果表明，SBD-1在蛋白水平的表達(dá)趨勢(shì)與mRNA水平相似。用不同濃度的β-葡聚糖(5、10、20、50和100 μg·mL-1)刺激綿羊RECs后檢測(cè)SBD-1的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，用10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs后極顯著增加了RECs中SBD-1的蛋白表達(dá)(P<0.01，圖7A)。接下來(lái)，用10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs 0～24 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SBD-1蛋白的表達(dá)最大刺激時(shí)間為4 h(P<0.01，圖7B)。這表明，β-葡聚糖刺激RECs后均能提高共培養(yǎng)上清中SBD-1的蛋白表達(dá)，且當(dāng)濃度10 μg·mL-1刺激4 h SBD-1的蛋白表達(dá)達(dá)到峰值。

A.β-葡聚糖不同刺激濃度對(duì)SBD-1蛋白表達(dá)的影響；B. β-葡聚糖不同刺激時(shí)間對(duì)SBD-1蛋白表達(dá)的影響
A. Effects of different concentrations of β-glucan on SBD-1 protein expression; B. Effects of β-glucan stimulated RECs at different times on SBD-1 protein expression
圖7 β-葡聚糖對(duì)綿羊RECs SBD-1蛋白表達(dá)的影響
Fig.7 Effect of β-glucan on the expression of sheep RECs SBD-1 protein

2.6 β-葡聚糖刺激綿羊RECs的不同濃度和時(shí)間對(duì)上皮細(xì)胞存活率的影響

為了確定β-葡聚糖可能的毒性，本研究用不同濃度β-葡聚糖(5、10、20、50和100 μg·mL-1)刺激RECs 8 h。使用MTT測(cè)定法檢測(cè)β-葡聚糖刺激RECs后上皮細(xì)胞的存活率。觀察到在RECs中β-葡 聚糖濃度為5、10、20、50 μg·mL-1(P> 0.05)對(duì)RECs沒(méi)有毒性，而濃度為100 μg·mL-1時(shí)發(fā)現(xiàn)顯著的細(xì)胞死亡(P< 0.05，圖8A)。而后，用10 μg·mL-1的β-葡聚糖刺激RECs 0～24 h后，觀察到β-葡聚糖濃度為10 μg·mL-1刺激RECs 0～24 h的細(xì)胞均存活(P> 0.05，圖8B)。

3 討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中抗生素一直被用于預(yù)防動(dòng)物疾病和促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[15]。然而，由于細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性負(fù)面影響的不斷增加[16]，抗生素替代品的開(kāi)發(fā)已成為研究的新熱點(diǎn)，而防御素被認(rèn)為是抗生素的潛在替代品之一。

A.β-葡聚糖不同刺激濃度對(duì)綿羊RECs活性影響; B. β-葡聚糖不同刺激時(shí)間對(duì)綿羊RECs活性影響
A. Effects of different concentrations of β-glucan on the activity of sheep RECs; B. Effect of β-glucan stimulated RECs at different times on the activity of sheep RECs
圖8 β-葡聚糖刺激綿羊RECs后細(xì)胞活性檢測(cè)
Fig.8 The sheep ruminal epthelial cell viability after β-glucan treatment

以往的研究表明，益生菌、維生素D3、丁酸、膽汁酸和維甲酸可以誘導(dǎo)反芻動(dòng)物、人或家禽體內(nèi)宿主防御肽(host defence peptides，HDPs)的表達(dá)，并增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力[17-20]。因此，通過(guò)飲食調(diào)節(jié)來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)源性HDPs的表達(dá)是一種用于控制和預(yù)防疾病的新型抗微生物方法。而酵母β-葡聚糖是一種從釀酒酵母細(xì)胞壁中提取的多糖，已被廣泛研究，并被證明具有涉及受體識(shí)別的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠最有效地增強(qiáng)哺乳動(dòng)物物種中的宿主先天性免疫反應(yīng)[21-24]。

盡管許多多糖被證明是參與激活宿主防御機(jī)制的成分，但有關(guān)釀酒酵母細(xì)胞壁成分β-葡聚糖與先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的抗微生物肽防御素的表達(dá)關(guān)系仍少見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。Van Der Marel等[12]和Schmitt等[13]的研究結(jié)果表明，在魚(yú)飲食中補(bǔ)充一定劑量的酵母聚糖能夠促進(jìn)鰓中β-防御素-2和皮膚中β-防御素基因的表達(dá)以及腸上皮細(xì)胞中防御素和cathelicidins的分泌。同樣，Campoverde等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在大西洋白姑魚(yú)體內(nèi)注射β-葡聚糖24 h后，腎中β-防御素的表達(dá)顯著上調(diào)，而在體外培養(yǎng)的腎和腸細(xì)胞中與β-葡聚糖分別共培養(yǎng)4或24 h后β-防御素的表達(dá)增加，之后呈下降趨勢(shì)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖以劑量和時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)SBD-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，并且低濃度的β-葡聚糖(10 μg·mL-1) 刺激RECs 2或4 h就能有效誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最高，而后呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明利用釀酒酵母細(xì)胞壁成分β-葡聚糖作為誘導(dǎo)劑，特異性誘導(dǎo)β-防御素在RECs內(nèi)的高效表達(dá)具有可行性，且β-葡聚糖對(duì)機(jī)體的誘導(dǎo)效果可能取決于作用的劑量和時(shí)間，太低的劑量或刺激時(shí)間較短誘導(dǎo)效果不明顯，而太高的劑量或刺激時(shí)間較長(zhǎng)具有抑制作用。由此提示，在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，β-葡聚糖在RECs上誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá)過(guò)程可能是機(jī)體自身的一種調(diào)節(jié)過(guò)程，即當(dāng)用β-葡聚糖刺激RECs后SBD-1的表達(dá)量升高，但達(dá)到最高時(shí)機(jī)體也會(huì)隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸將SBD-1的表達(dá)量調(diào)節(jié)到自身基礎(chǔ)水平，從而保持SBD-1表達(dá)的穩(wěn)態(tài)。

另有研究表明，益生菌分子與宿主的相互作用可能是益生菌發(fā)揮益生效應(yīng)的基礎(chǔ)，如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的主要細(xì)胞壁成分肽聚糖和脂磷壁酸，革蘭氏陰性細(xì)菌的主要細(xì)胞壁成分脂多糖，均被認(rèn)為是免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵組分[26-29]，而本研究中證明的釀酒酵母菌細(xì)胞壁成分β-葡聚糖能夠誘導(dǎo)SBD-1的表達(dá)，同樣也可猜測(cè)為β-葡聚糖在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，但是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究利用體外培養(yǎng)的綿羊RECs，從mRNA和蛋白質(zhì)水平證明了釀酒酵母菌一個(gè)主要的細(xì)胞壁成分β-葡聚糖能夠上調(diào)綿羊RECsSBD-1基因的表達(dá)，且β-葡聚糖濃度為10 μg·mL-1分別刺激RECs 2和4 h后SBD-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平達(dá)到最高，此結(jié)果為今后β-葡聚糖制劑添加于飼料中最佳的添加比例和飼喂間隔時(shí)間提供理論依據(jù)。