堿性土上GF677與毛桃植株生理指標(biāo)及葉片組織結(jié)構(gòu)對比研究

陳 棟，邱東昀，鐘小江，祝 進(jìn)，宋海巖，李 靖，楊文淵，江國良*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066;2.樂山市市中區(qū)脆紅李技術(shù)協(xié)會(huì)，四川 樂山 614000;3.宜賓縣農(nóng)業(yè)局果樹站，四川 宜賓 644600;4.四川省園藝推廣總站，四川 成都 610016)

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

供試材料為抗性桃砧木GF677(扦插苗)，以普通毛桃(實(shí)生苗)為對照。

試驗(yàn)地位于四川省簡陽市周家鄉(xiāng)南沖堰村四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所晚熟桃示范基地(N30°30′50.97″，E104°26′35.21″)，屬亞熱帶濕潤氣候，年平均氣溫17 ℃，年降雨量900 mm。試驗(yàn)地塊上茬作物為桃樹，已種植20余年，園區(qū)土壤為侏羅系和白堊系紫色砂頁巖發(fā)育而成的石灰性紫色土[8]，土壤背景值：pH值8.44，有機(jī)質(zhì)6.53 g/kg，全氮0.60 g/kg，全磷0.631 g/kg，全鉀20.03 g/kg，陽離子交換量19.2 cmol(+)/kg，全鐵63.3 g/kg，有效鋅0.54 mg/kg，有效鐵19.4 mg/kg，有效錳5.5 mg/kg，交換性鈣81.0 cmol 1/2Ca2+/kg，交換性鎂1.6 cmol 1/2 Mg2+/kg。2014年采取聚土起壟方式改土重建，株行距為1 m×4.5 m，栽植時(shí)GF677和毛桃均為1年生苗，本試驗(yàn)測定時(shí)間為2016年5-10月。

1.2 試驗(yàn)方法

選取生長勢一致的GF677與毛桃實(shí)生苗，單株為1重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。自5月5日起每隔1月左右從每株樹上選取樹冠各方位、無病蟲害新梢中部成熟功能葉10片，拍照后放入液氮帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生理生態(tài)指標(biāo)測定及葉綠素合成前體含量測定，另取鮮葉2片放入FAA固定液中用于制作石蠟切片，2片放入2.5 %戊二醛中用于觀察葉綠體顯微結(jié)構(gòu)。

(1)抗氧化酶系統(tǒng)：過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法、超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT還原比色法、過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫比色法。

(2)MDA含量：采用硫代巴比妥酸法。

(3)相對電導(dǎo)率：使用德國WTW 公司Cond315i電導(dǎo)率儀。

(4)不同時(shí)期枝條及根系可溶性蛋白含量測定：采用考馬斯亮藍(lán)G250顯色法，參照李合生[9]。

(5)不同時(shí)期枝條及根系可溶性糖及可溶性淀粉含量測定：

可溶性糖采用蒽酮-濃硫酸比色法測定，可溶性淀粉采用高氯酸浸提，蒽酮-濃硫酸比色法，參照李合生[9]。

(6)不同時(shí)期根系高鐵還原酶活性測定參照陳麗茜[10]，方法略有改動(dòng)。反應(yīng)液組成：0.5 mM CaSO4，0.1 mM Mes (4-morpho-lineethanesulfonie acid)，0.1 mM BPDS(4,7-dipheny1-1，10-phenanhroline-disufonic acid)和100 μM Fe-EDTA，用1M NaOH將pH調(diào)到5.5。用蒸餾水清洗處理后的根2～3次，置于0.5 mM CaSO4溶液中5 min。取鮮根置于10～20 mL試管中，加入20 mL反應(yīng)液，在25 ℃黑暗條件下反應(yīng)1 h，并每隔15 min振蕩反應(yīng)液一次。在535 nm波長下測量反應(yīng)液吸光度，以不加根樣的反應(yīng)液為空白對照。將根取出用吸水紙吸干水分，稱取對應(yīng)根樣的重量。最后，根據(jù)Fe2+濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到反應(yīng)液中Fe2+的量，并由此計(jì)算出高鐵還原酶的活性(以μmol·g-1FW·h-1計(jì))。

(7)新鮮葉片制成石蠟切片，步驟如下：葉片組織固定于4 %多聚甲醛，常規(guī)脫水包埋切片，脫蠟至水份干后用番紅固綠染液A染色2 h，之后用自來水沖洗；梯度酒精脫色各1～2 min；用番紅固綠染液B染色1～2 min；無水乙醇脫水3～5 min；最后用二甲苯透明，中性樹膠封片。使用圖像測量軟件Digimizer4.3.4觀測葉片上、下表皮、柵欄組織和海綿組織。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片抗氧化酶系統(tǒng)比較

POD是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫，氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。

圖中**表示該時(shí)期同一指標(biāo)在P<1 %水平上差異顯著，*表示該時(shí)期同一指標(biāo)在P<5 %水平上差異顯著，下同** in the picture indicates in P<1 % significant level in the same period and * in the picture indicates in P<5 % significant level in the same period，the same as below圖1 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期葉片SOD酶活性變化Fig.1 SOD activities of leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖2 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期葉片POD酶活性變化Fig.2 POD activities of leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由圖2可知，堿性土上不同時(shí)期GF677葉片POD酶活性呈現(xiàn)先下降后略微上升的趨勢，在5月5日至9月29日6個(gè)時(shí)期均極顯著高于毛桃，甚至達(dá)到毛桃POD酶活性的2倍。

CAT是一種酶類清除劑，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。由圖3可知，GF677葉片因受到堿脅迫而導(dǎo)致CAT酶活性短期內(nèi)略微升高，但隨著堿脅迫時(shí)間的增加葉片CAT酶活性降低，最低值(120.19 U·g-1·min-1)出現(xiàn)在7月29日，隨后由于GF677葉片適應(yīng)堿脅迫后CAT活性開始上升。而毛桃葉片CAT酶活性受堿脅迫后呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，最低值(72.57 U·g-1·min-1)出現(xiàn)在7月29日。GF677CAT酶活性在6月29日至9月29日4個(gè)時(shí)期均顯著或極顯著高于毛桃。

3種抗氧化酶(尤其是含有鐵卟啉為輔基的POD和CAT)不同時(shí)期的變化，表明毛桃在受到堿脅迫后鐵素吸收受阻，造成鐵卟啉為輔基的POD和CAT酶活性顯著或極顯著低于GF677。GF677葉片在受到堿脅迫時(shí)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)能夠提高活性，減輕代謝產(chǎn)物的毒害，GF677表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性。

圖3 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期葉片CAT酶活性變化Fig.3 CAT activities of leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖4 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期葉片丙二醛含量變化Fig.4 Malondialdehyde content of leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖5 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期葉片相對電導(dǎo)率變化Fig.5 Relative electrolytic leakage of leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

2.2 葉片MDA含量比較

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。由圖4可知，堿性土上不同時(shí)期GF677和毛桃葉片MDA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，單毛桃葉片MDA含量在5月5日至6月29日以及9月2日至9月29日多個(gè)時(shí)期顯著或極顯著高于GF677。表明毛桃受堿脅迫后葉片膜系統(tǒng)受損程度大于GF677。

2.3 相對電導(dǎo)率比較

細(xì)胞膜透性的大小可間接的用組織的相對電導(dǎo)率衡量。組織相對電導(dǎo)率越高，說明細(xì)胞膜完整性遭到破壞的程度就越大。由圖5可知，堿性土上不同時(shí)期GF677葉片相對電導(dǎo)率變化呈現(xiàn)不明顯，而毛桃葉片電導(dǎo)率呈現(xiàn)先迅速上升后趨于平緩的趨勢，最高值(0.49)出現(xiàn)在9月29日，隨脅迫程度增加自5月27日起毛桃葉片相對電導(dǎo)率均極顯著高于GF677葉片。再次表明毛桃在受到堿脅迫后葉肉細(xì)胞的細(xì)胞膜受到破壞，GF677表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性。

圖6 堿性上GF677和毛桃不同時(shí)期枝條可溶性蛋白含量變化Fig.6 Soluble protein content of branches of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖7 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期根系可溶性蛋白含量變化Fig.7 Soluble protein content of roots of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

2.4 不同時(shí)期枝條及根系可溶性蛋白含量變化

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，因此經(jīng)常用作篩選抗性的指標(biāo)之一。由圖6可知，堿性土上不同時(shí)期GF677枝條可溶性蛋白含量變化不大，而毛桃枝條可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降然后趨于平緩的趨勢，最高峰(2.06 mg/g)出現(xiàn)在5月5日，其中在3月10日、5月5日、9月2日和9月29日多個(gè)時(shí)期毛桃枝條可溶性蛋白含量顯著或極顯著高于GF677。

由圖7可知，堿性土上GF677與毛桃根系可溶性蛋白含量變化不大。表明通過枝條與根系可溶性蛋白含量難以鑒別桃樹抗黃化能力。

2.5 不同時(shí)期枝條及根系可溶性糖及可溶性淀粉含量變化

可溶性糖是干旱脅迫誘導(dǎo)的小分子溶質(zhì)之一，其種類主要包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖等。這些可溶性糖類參與滲透調(diào)節(jié)，并可能在維持植物蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面起到重要作用。由圖8～11可知，堿性土上不同時(shí)期GF677與毛桃枝條可溶性糖變化趨勢相近，但仍有不同：1月25日第1次測定時(shí)GF677枝條可溶性糖含量極顯著高于毛桃，5月5日GF677枝條可溶性糖含量顯著高于毛桃。堿性土上不同時(shí)期GF677和毛桃枝條可溶性淀粉變化趨勢相近，但在5月5日、5月27日和7月29日至9月29日期間GF677枝條可溶性淀粉含量均極顯著高于毛桃。

圖8 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期枝條可溶性糖含量變化Fig.8 Soluble sugar content of branches of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖9 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期枝條可溶性淀粉含量變化Fig.9 Soluble starch content of branchs of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖10 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期根系可溶性糖含量變化Fig.10 Soluble sugar content of roots of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

堿性土上不同時(shí)期GF677和毛桃根系可溶性糖含量均呈現(xiàn)先下降后上升最后趨于平緩的趨勢，且毛桃根系可溶性糖含量一直高于GF677，5月5日至9月29日期間毛桃根系可溶性糖含量均顯著或極顯著高于GF677。而堿性土上不同時(shí)期GF677和毛桃根系可溶性淀粉變化趨勢相近，僅在9月2日GF677根系可溶性淀粉含量顯著高于毛桃。

結(jié)合圖8～11表明GF677植株體內(nèi)更多的營養(yǎng)物質(zhì)是以可溶性淀粉形式儲(chǔ)存于枝條中，而毛桃植株體內(nèi)主要以可溶性糖形式儲(chǔ)存于根系中。

2.6 不同時(shí)期根系高鐵還原酶活性變化

由圖12可知，堿性土上不同時(shí)期GF677根系高鐵還原酶(FCR)活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最高峰(101.90 μmol·g-1FW·h-1)出現(xiàn)在9月2日，毛桃根系FCR活性呈現(xiàn)先上升后下降然后又上升最后再下降的趨勢，最高峰(80.35 μmol·g-1FW·h-1)出現(xiàn)在5月5日，在5月5日毛桃根系FCR活性極顯著高于GF677，隨后下降并于6月29日之后的4個(gè)時(shí)期均顯著或極顯著低于GF677。

圖11 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期根系可溶性淀粉含量變化Fig.11 Soluble starch content of roots of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

圖12 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期根系FCR活性變化Fig.12 FCR activities of roots of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

2.7 葉片石蠟切片觀察

植物在出現(xiàn)黃化病癥時(shí)往往葉片會(huì)出現(xiàn)葉肉細(xì)胞空腔、解體，葉片厚度變薄，葉片卷曲等癥狀[11-12]。由圖13-a可知，在堿性土上不同時(shí)期GF677葉片葉肉細(xì)胞充實(shí)，排列緊密，柵欄組織與海綿組織分布清晰(圖13-a,c,e,g,i,k,m)，沒有出現(xiàn)空腔或解體的現(xiàn)象。而毛桃在堿性土上葉片出現(xiàn)空腔，柵欄組織與海綿組織均出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象(圖13-b,d,f,h,j,l,n)，尤其是海綿組織，除7月29日外(圖13-j)，均出現(xiàn)較大程度的空腔，表明毛桃在堿性土上葉片肉細(xì)胞受到極大的損傷，尤其是海綿組織退化明顯。

3 討 論

植物在受到脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基、過氧化氫和酚類、胺類抗氧化酶系以及丙二醛等代謝產(chǎn)物對植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害[13-14]。對堿性土上不同時(shí)期GF677和毛桃葉片抗氧化酶系統(tǒng)的幾種酶類活性進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn)，GF677葉片兩種含有鐵卟啉為輔基的酶類：POD、CAT酶活性在全部或部分生長期內(nèi)均高于毛桃(尤其是POD酶活性在全生長期均極顯著高于毛桃)，體內(nèi)丙二醛含量和相對電導(dǎo)率均低于毛桃，而SOD酶活性略低于毛桃，表明GF677在堿性土上葉片體內(nèi)抗氧化酶活性升高并及時(shí)清理各種有毒物質(zhì)，而毛桃體內(nèi)鐵有效性降低，導(dǎo)致含有鐵卟啉為輔基的酶類活性低于GF677，毛桃清除體內(nèi)活性氧主要依靠SOD，因而GF677表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗逆性。劉赟[15]等人研究硫酸亞鐵銨對香樟葉片黃化的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，黃化香樟葉片POD活性明顯下降，而施用硫酸亞鐵銨后能顯著提高黃香樟葉片的POD活性。陳棟等人[7]的研究發(fā)現(xiàn)黃化桃葉CAT活性與SOD活性變化趨勢相反，而肖家欣等人[16]的研究表明黃化葉片CAT活性甚至高于正常葉，由此可見不同黃化植株CAT酶活性變化較為復(fù)雜，仍有待進(jìn)一步研究。

a:“GF677”3月10日;b：毛桃3月10日；c:“GF677”4月28日；d：毛桃4月28日；e：“GF677”5月27日；f：毛桃5月27日；g：“GF677”6月29日;h:毛桃6月29日；i：“GF677”7月29日；j：毛桃7月29日；k：“GF677”9月2日；l：毛桃9月2日；m：“GF677”9月29日；n：毛桃9月29日(以上圖片均為400倍鏡下觀察所得)a:‘GF677’on March 10th;b:wild peach on March 10th ；c:‘GF677’on April 28th ；d：wild peach on April 28th ；e：‘GF677’on May 27th ；f：wild peach on May 27th ；g：‘GF677’on June 29th;h:wild peach on June 29th ；i：‘GF677’on July 29th ；j：wild peach on July 29th ；k：‘GF677’on September 2nd；l：wild peach on September 2nd；m：‘GF677’on September 29th ；n：wild peach on September 29th (All the pictures above were magnified 400 times in the microscopic observation)圖13 堿性土上GF677和毛桃不同時(shí)期葉片石蠟切片觀察Fig.13 Paraffin sections of leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

MDA和相對電導(dǎo)率也是反映植物逆境脅迫程度的重要指標(biāo)。通常植物在遭受脅迫后，細(xì)胞脂膜過氧化產(chǎn)物MDA會(huì)升高，細(xì)胞受損并會(huì)導(dǎo)致相對電導(dǎo)率的升高[17-18]。本試驗(yàn)中毛桃葉片MDA含量在多個(gè)時(shí)期顯著或極顯著高于GF677，且葉片相對電導(dǎo)率在多個(gè)時(shí)期極顯著高于GF677，表明毛桃在堿性土上受到了較強(qiáng)的堿脅迫，葉片細(xì)胞受損嚴(yán)重。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，可溶性蛋白增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，因此經(jīng)常用作篩選抗性的指標(biāo)之一[19]。李音音[20]在研究黃化甜瓜生物學(xué)特性時(shí)甚至發(fā)現(xiàn)葉片黃化的甜瓜植株9388-1其可溶性蛋白含量高于正常甜瓜品種白莎蜜1號。然而本試驗(yàn)中GF677與毛桃在受到堿脅迫后枝條與根系可溶性蛋白含量變化幅度不大或趨勢相近，難以鑒別桃樹抗黃化能力。

可溶性糖是干旱脅迫誘導(dǎo)的小分子溶質(zhì)之一，其種類主要包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖等。這些可溶性糖類參與滲透調(diào)節(jié)，并可能在維持植物蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面起到重要作用[21]。而可溶性淀粉作為植物體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，可以反映植物的養(yǎng)分充足情況[22]。結(jié)合圖8～11表明GF677植株體內(nèi)更多的營養(yǎng)物質(zhì)是以可溶性淀粉形式儲(chǔ)存于枝條中，而毛桃植株體內(nèi)主要以可溶性糖形式儲(chǔ)存于根系中。

高鐵還原酶又稱被為三價(jià)鐵螯合還原酶(ferric-chelate reductases，F(xiàn)ROs)家族屬于flavocyto chromes超家族中的1個(gè)亞類[23]，是雙子葉植物和非禾本科單子葉植物應(yīng)答鐵脅迫的關(guān)鍵酶之一[24]，能夠?qū)⒓?xì)胞質(zhì)膜上的Fe3+-螯合物還原成2價(jià)并通過Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。在缺鐵條件下，植物FRO基因表達(dá)是正常生長條件下表達(dá)量的4～5倍，以高效利用土壤中的鐵[25]。陳微微[26]在研究擬南芥缺鐵細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺鐵條件下，雙子葉植物擬南芥通過誘導(dǎo)根系FCR活性，促進(jìn)根際Fe3+的還原來適應(yīng)低鐵環(huán)境。葉義全[27]在研究蔗糖和一氧化氮對植物缺鐵響應(yīng)的調(diào)控作用及其機(jī)制時(shí)也發(fā)現(xiàn)缺鐵會(huì)導(dǎo)致擬南芥根系FCR活性升高。本試驗(yàn)在堿脅迫下，毛桃根系FCR活性會(huì)在短時(shí)間內(nèi)急劇上升又迅速下降，而GF677根系FCR活性會(huì)持續(xù)上升，表明缺鐵會(huì)誘導(dǎo)GF677與毛桃根系FCR活性的上升，但GF677能夠在更長的時(shí)間內(nèi)適應(yīng)堿脅迫，保持較高的FCR活性，從而保證對鐵素的還原與吸收。

植物在出現(xiàn)黃化病癥時(shí)往往葉片會(huì)出現(xiàn)葉肉細(xì)胞空腔、解體，葉片厚度變薄，葉片卷曲等癥狀。在堿性土上不同時(shí)期GF677葉片葉肉細(xì)胞充實(shí)，排列緊密，柵欄組織與海綿組織分布清晰。而毛桃在堿性土上葉片出現(xiàn)空腔，柵欄組織與海綿組織均出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象，尤其是海綿組織，除7月29日外(圖13-j)，均出現(xiàn)較大程度的空腔，這與黎秀麗等人[28]對庫爾勒香梨黃化病葉結(jié)構(gòu)的觀察所得結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

綜上所述，GF677葉片在受到堿脅迫時(shí)體內(nèi)含鐵卟啉為輔基的酶類POD、CAT酶活性更高，保證了體內(nèi)活性氧的及時(shí)清除，而毛桃葉片MDA與相對電導(dǎo)率在受到堿脅迫后明顯升高，葉肉細(xì)胞受損嚴(yán)重。GF677植株體內(nèi)更多的營養(yǎng)物質(zhì)是以可溶性淀粉形式儲(chǔ)存于枝條中，而毛桃植株體內(nèi)主要以可溶性糖形式儲(chǔ)存于根系中。堿脅迫同時(shí)誘導(dǎo)了毛桃與GF677根系高鐵還原酶活性的上升，但毛桃根系FCR活性會(huì)在短時(shí)間內(nèi)急劇上升又迅速下降，而GF677根系FCR活性會(huì)持續(xù)上升，表明GF677能夠在更長的時(shí)間內(nèi)適應(yīng)堿脅迫，保持較高的FCR活性，從而保證對鐵素的還原與吸收。GF677作為引入我國的抗性砧木資源，在四川盆地堿性土上表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗堿抗黃化能力，在植株抗氧化系統(tǒng)、植株養(yǎng)分狀況和根系鐵還原能力上均強(qiáng)于毛桃，在生產(chǎn)上具有較好的推廣前景。本試驗(yàn)為今后評價(jià)桃砧木資源抗堿抗黃化能力提供了可靠的依據(jù)。