廣西西瓜、甜瓜細(xì)菌性果斑病菌檢測(cè)及藥劑毒力測(cè)定

謝慧婷，李戰(zhàn)彪，譚海文，秦碧霞，崔麗賢，蔡健和*

(1. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；3.廣西桂林市蔬菜研究所，廣西 桂林 541004)

【研究意義】瓜類細(xì)菌性果斑病(Bacrerial Fruit of Blotch，BFB)是一種檢疫性植物病害，對(duì)瓜類作物具有毀滅性。目前在全國西瓜甜瓜主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其病原菌為西瓜嗜酸菌(Acidororaxcitrulli)[1]，可侵染西瓜、甜瓜等多種葫蘆科作物。病菌主要通過種子進(jìn)行傳播，在種子中的存活時(shí)間可長達(dá)19年，抗干旱和衰老能力強(qiáng)[2-3]，病菌在含病殘?bào)w的土壤中可存活12個(gè)月，在不含病殘?bào)w的土壤中可存活8個(gè)月[4]。當(dāng)條件適宜時(shí)，潛在的病菌可導(dǎo)致病害的大面積爆發(fā)，給西瓜甜瓜種植業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。廣西常年種植西瓜甜瓜面積約10萬hm2[5]，該病害從20世紀(jì)90年代中期開始在廣西發(fā)生為害，導(dǎo)致許多育苗場(chǎng)損失慘重[6]。因此，開展有關(guān)細(xì)菌性果斑病菌抑制藥劑的研究，建立細(xì)菌性果斑病菌的PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于預(yù)防病害通過帶病種子種苗傳播擴(kuò)散，從而控制廣西疫情的蔓延具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于瓜類細(xì)菌性果斑病病害的藥劑防治研究報(bào)道較多，但是各地防治效果有所不同。趙廷昌等[7]發(fā)現(xiàn)種子消毒以3 %鹽酸處理效果最好，其次為47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑和新植霉素。王中武等[8]發(fā)現(xiàn)47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑和90 %新植霉素可溶粉劑在苗期發(fā)病時(shí)用藥效果最好。黃金艷等[9]利用春雷霉素對(duì)嫁接前西瓜接穗材料進(jìn)行處理降低了發(fā)病率。王雪等[10]的研究表明，西瓜菌株和甜瓜菌株對(duì)同一藥劑的敏感性差異較大。陳海燕等[11]對(duì)海南甜瓜細(xì)菌性果斑病進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，結(jié)果表明20 %二氯異氰尿酸鈉可濕性粉劑防效最好。張路生等[12]的研究表明88 %水合霉素、33.5 %喹啉酮和72 %農(nóng)用鏈霉素對(duì)山東省瓜類細(xì)菌性果斑病菌的抑制效果較好。賈云鶴等[13]對(duì)黑龍江省西瓜細(xì)菌性果斑病進(jìn)行防治藥劑的篩選，研究發(fā)現(xiàn)雙氧水、硫酸鏈霉素、噻霉酮、福爾馬林、氫氧化銅、春雷霉素和新植霉素對(duì)病菌具有較好的抑制作用。王爽等[14]的研究發(fā)現(xiàn)噻霉酮、農(nóng)用鏈霉素、中生菌素和春雷霉素對(duì)海南西瓜細(xì)菌性果斑病菌的抑菌效果較好?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然國內(nèi)關(guān)于西瓜類細(xì)菌性果斑病的藥劑防治的研究較多，但各地研究結(jié)果差異較大，對(duì)廣西該病害防治工作的參考作用有限?！緮M解決的關(guān)鍵問題】有針對(duì)性地選取實(shí)際生產(chǎn)中常用的13種細(xì)菌性藥劑，采用抑菌圈法對(duì)廣西瓜類細(xì)菌性果斑病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，篩選出具有較好防效的藥劑，為廣西開展該病害的藥劑防治工作提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品來源：2014-2017年間廣西各地植保植檢部門、種苗公司、育苗戶等送檢的葫蘆、西瓜、南瓜、甜瓜等葫蘆科種子種苗樣品以及本研究采集到的疑似病樣。

DNA提取及PCR擴(kuò)增：參考植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提供的方法進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，檢測(cè)所選引物參考邱曉靜[15]BX-SL1:5′-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3′/SR2: 5′- GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3′，273 bp，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(10.0 μl)：2×TaqMasterMix 5.0 μl，引物BX-SL1 (10 μmol/L)和SR2 (10 μmol/L)各0.5 μl，菌體DNA模板0.5 μl，雙蒸水3.5 μl。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s和72 ℃45 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

供試藥劑：1號(hào)殺菌劑(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所趙廷昌教授贈(zèng)送)、40 %甲醛(成都市科龍化工試劑廠)、硫酸鏈霉素(南京奧多福尼生物科技有限公司)、72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑(華北制藥股份有限公司)、80 %乙蒜素乳油(河南科邦化工有限公司)、12 %中生菌素母藥(福建凱立生物制品有限公司)、64 %殺毒礬可濕性粉劑(先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)、47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑(日本北興化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)、30 %琥膠肥酸銅可濕性粉劑(齊齊哈爾四友化工有限公司)、20 %嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑(齊齊哈爾四友化工有限公司)、46 %氫氧化銅水分散粒劑(美國杜邦公司)、20 %噻菌銅懸浮劑(浙江龍灣化工有限公司)和2 %春雷霉素水劑(日本北興化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)。

供試病原菌：菌株WM0922-3分離自厚皮甜瓜葉片，菌株XD0611-7分離自薄皮甜瓜果實(shí)，菌株XD0819-2分離自西瓜品種(籽瓜)果實(shí)，3個(gè)供試菌株均已完成科赫氏法則，結(jié)合16S rDNA序列分析，證明供試菌株均為西瓜嗜酸菌(Acidororaxcitrulli)[16]。供試菌株在YDC培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BFB檢出率統(tǒng)計(jì)方法 對(duì)種子種苗及樣品進(jìn)行BFB檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析檢出率。

1.2.2 藥劑濃度配制 參考各藥劑推薦使用劑量，每個(gè)藥劑選擇5個(gè)梯度濃度，按照濃度由高到低的順序依次使用無菌水稀釋，各濃度藥劑現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 帶菌培養(yǎng)基制備采用抑菌圈打孔法[17]將KB培養(yǎng)基與各菌懸液濃度約為1(108cfu/mL)按10∶1的體積比分別混勻，每皿20 mL，制成帶菌平板，用直徑5 mm的滅菌打孔器在每皿打5個(gè)孔，將40 μl藥劑分別加入已編號(hào)孔中，每濃度3個(gè)重復(fù)，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 根據(jù)公式計(jì)算菌落生長抑菌率(%)=[(處理抑菌圈直徑-對(duì)照抑菌圈直徑)/處理抑菌圈直徑]×100；采用DPS v7.05版軟件進(jìn)行毒力回歸方程數(shù)據(jù)分析，以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為自變量，抑菌率的幾率值為因變量，建立毒力回歸方程，并求出各藥劑的EC50及相關(guān)系數(shù)R2，比較不同藥劑的抑菌率[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BFB檢測(cè)情況

2014-2017年送檢的葫蘆種子包括韓砧一號(hào)、安生、金砧一號(hào)、本地葫蘆和來自山東、甘肅等地的散裝葫蘆種，南瓜種子包括雪砧金剛、壯士、吉冠373等，西瓜種子包括農(nóng)優(yōu)新一號(hào)、珠農(nóng)大美人、甜王三號(hào)等，甜瓜種子包括蜜語香瓜、丁型香瓜等。送檢的葫蘆種子、南瓜種子、西瓜種子及種苗、果實(shí)均檢出BFB(表1)。4年合計(jì)送檢種子345份，其中葫蘆種子203份，檢出率為6.4 %；南瓜種子31份，檢出率為9.68 %；西瓜種子66份，檢出率為4.55 %；甜瓜種子45份，檢出率為26.67 %；送檢西瓜嫁接苗65份，檢出率為7.69 %。

期間課題組從廣西南寧、桂林、賀州、北海、百色等市采集西瓜、甜瓜樣品共計(jì)405份(表2)，其中西瓜樣品187份，檢出率為10.69 %；厚皮甜瓜樣品186份，檢出率為6.99 %；薄皮甜瓜樣品32份，檢出率為18.75 %。從南寧、北海、賀州市采集的樣品中BFB檢出率較高，從百色市采集的樣品中未檢出BFB，部分樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果見圖1。

2.2 13種殺菌劑對(duì)3個(gè)菌株抑菌率比較

在13種殺菌劑中，其中7種殺菌劑對(duì)菌株WM0922-3、XD0611-7 和XD0819-2具有不同的抑制效果(表3)，且每種有效殺菌劑的抑制效果均與藥劑濃度呈正比，其中以1號(hào)殺菌劑的抑制效果最好，最高濃度藥劑對(duì)3個(gè)菌株的抑菌率均超過83.00 %；其次為40 %甲醛、72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑、80 %乙蒜素乳油和64 %殺毒礬可濕性粉劑。其中，硫酸鏈霉素和12 %中生菌素母藥對(duì)WM0922-3和XD0611-7具有抑制效果，對(duì)XD0819-2卻沒有抑制作用；72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑對(duì)XD0819-2的抑制效果明顯低于WM0922-3和XD0611-7，且在最低濃度時(shí)對(duì)XD0819-2沒有抑制作用；64 %殺毒礬可濕性粉劑對(duì)XD0819-2的抑制效果優(yōu)于WM0922-3和XD0611-7。

表1 2014-2017年送檢種子和種苗檢測(cè)結(jié)果

表2 2014-2017年田間采集疑似病樣檢測(cè)結(jié)果

M：MarkerDL2000；CK：清水對(duì)照；-：陰性對(duì)照；+：陽性對(duì)照；1～4：待測(cè)樣品M;MarkerDL2000;CK:Water control; -:Negative control; +:Positive control; 1-4:Samples圖1 細(xì)菌性果斑病菌PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR test result of A. citrulli

余下6種殺菌劑：47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑(藥劑濃度1000～2000 mg·L-1)、30 %琥膠肥酸銅可濕性粉劑(藥劑濃度2400～4000 mg·L-1)、20 %嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑(藥劑濃度2500～4500 mg·L-1)、46 %氫氧化銅水分散粒劑(藥劑濃度400～800 mg·L-1)、20 %噻菌銅懸浮劑(藥劑濃度1000～2000 mg·L-1)和2 %春雷霉素水劑(藥劑濃度1500～3100 mg·L-1)均未對(duì)菌株表現(xiàn)出抑制作用。

2.3 殺菌劑對(duì)3個(gè)菌株的毒力回歸方程

根據(jù)EC50結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)3個(gè)菌株WM0922-3、XD0611-7 和XD0819-2具有抑制作用的殺菌劑中，以1號(hào)殺菌劑的EC50最低，分別為0. 2×10-3、0. 1×10-3和0. 4×10-3mg·L-1；其次為40 %甲醛，EC50均小于0.06 mg·L-1；72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑對(duì)WM0922-3和XD0611-7的抑制作用優(yōu)于XD0819-2，而80 %乙蒜素乳油和64 %殺毒礬可濕性粉劑對(duì)XD0819-2的抑制作用均優(yōu)于WM0922-3和XD0611-7(表4～6)。

表3 7種殺菌劑對(duì)3個(gè)果斑病菌株的抑菌率比較

續(xù)表3 Continued table 3

藥劑名稱Name of bactericide藥劑濃度Concentration of bactericideWM0922-3XD0611-7XD0819-2平均抑菌圈直徑(mm)Diameter of inhibition zone 抑菌率(%)Bacteriostasis平均抑菌圈直徑(mm)Diameter of inhibition zone抑菌率(%)Bacteriostasis平均抑菌圈直徑(mm)Diameter of inhibition zone抑菌率(%)Bacteriostasis100 mg·L-110.1750.8210.3351.615.000.00150 mg·L-113.3362.5011.8357.755.000.00200 mg·L-114.6765.9113.0061.545.000.00250 mg·L-115.0066.6715.0066.675.000.0072 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑Streptomycin 72 % SP100 mg·L-111.0054.5510.0050.005.000.00200 mg·L-113.6763.4114.0064.297.5033.33300 mg·L-116.3369.3616.0068.758.3340.00400 mg·L-118.6773.2118.3372.738.8343.40500 mg·L-120.3375.4119.6774.588.8343.4080 %乙蒜素乳油Ethylicin 80 % EC280 mg·L-110.0850.4111.1755.2211.0054.55310 mg·L-110.3351.6111.5056.5211.3355.88340 mg·L-110.3351.6111.8357.7511.0054.55370 mg·L-110.8353.8512.3359.4611.3355.88400 mg·L-111.6757.1412.8361.0411.6757.1412 %中生菌素母藥Zhongshengmycin 12 %200 mg·L-15.509.096.3321.055.000250 mg·L-15.8314.296.5323.475.000300 mg·L-16.0016.677.6734.785.000350 mg·L-17.0028.578.0037.505.000400 mg·L-17.1730.238.3340.005.00064 %殺毒礬可濕性粉劑Oxadixyl 64 % WP2500 mg·L-19.5047.375.6711.7615.5067.743000 mg·L-19.8349.1510.6753.1315.1767.033500 mg·L-111.1755.2211.3355.8816.4069.514000 mg·L-111.5056.5211.8357.7516.6770.004500 mg·L-111.6757.1412.6760.5319.0073.68

表4 不同殺菌劑對(duì)菌株WM0922-3的毒力回歸方程

表5 不同殺菌劑對(duì)菌株XD0611-7的毒力回歸方程

表6 不同殺菌劑對(duì)菌株XD0819-2的毒力回歸方程

3 討 論

本研究結(jié)果表明來自西瓜和甜瓜的3個(gè)果斑病菌株，各菌株對(duì)不同殺菌劑的敏感性有所不同，對(duì)同一殺菌劑的敏感性也不同。來自厚皮甜瓜和薄皮甜瓜的菌株WM0922-3和XD0611-7對(duì)藥劑的敏感性相似，但與來自西瓜品種(籽瓜)的菌株XD0819-2差異相對(duì)較大，這與王雪等[10]報(bào)道的結(jié)果相似。1號(hào)殺菌劑和40 %甲醛對(duì)3個(gè)菌株的防效均較好，這2種藥劑生產(chǎn)上主要用于種子處理，在最低濃度為0.1 %時(shí)防效分別達(dá)到75 %和55 %，這與董春玲等[19]報(bào)道的結(jié)果相似。72 %農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑對(duì)3個(gè)菌株的抑制效果均較好，對(duì)菌株WM0922-3和XD0611-7的抑制效果優(yōu)于菌株XD0819-2，與王雪等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。酸鏈霉素對(duì)WM0922-3和XD0611-7具有較好的抑制效果，但對(duì)XD0819-2卻沒有抑制作用，這與牛慶偉等[20]報(bào)道的結(jié)果有所差異，可能與生產(chǎn)廠商、商品純度，以及實(shí)驗(yàn)菌株不同有關(guān)。80 %乙蒜素乳油和64 %殺毒礬可濕性粉劑對(duì)XD0819-2的抑制效果較好，且優(yōu)于WM0922-3和XD0611-7，殺毒礬是防治卵菌類真菌病害的常用藥劑，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)菌性果斑病菌也有較好效果，這與田英等[21]的研究結(jié)果一致。47 %加瑞農(nóng)可濕性粉劑、30 %琥膠肥酸銅可濕性粉劑、20 %嗎胍·乙酸銅可濕性粉劑、46 %氫氧化銅水分散粒劑、20 %噻菌銅懸浮劑、2 %春雷霉素水劑等細(xì)菌性病害常用藥劑在本實(shí)驗(yàn)中均未發(fā)現(xiàn)有抑菌作用，這可能與生產(chǎn)上長期大量使用這幾種藥劑，細(xì)菌已產(chǎn)生較強(qiáng)抗藥性有關(guān)，這與王雪等[10]和萬秀琴等[22]報(bào)道的結(jié)果相似。

Walcott等[23]將64株瓜類細(xì)菌性果斑病菌分成兩個(gè)亞群，亞群1的菌株主要分離自甜瓜、南瓜等，亞群2的菌株主要分離自西瓜，且亞群1的菌株對(duì)硫酸銅不敏感。趙文龍等[24]對(duì)143株瓜類細(xì)菌性果斑病菌進(jìn)行硫酸銅敏感性檢測(cè)，結(jié)果表明果斑病菌具有穩(wěn)定的抗銅性，且寄主為甜瓜的菌株比寄主為西瓜的菌株的抗銅性更高。本研究結(jié)果也說明了果斑病菌對(duì)銅制劑不敏感，因此在生產(chǎn)上需謹(jǐn)慎使用銅制劑防治瓜類細(xì)菌性果斑病。

PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，廣西生產(chǎn)上使用的甜瓜、西瓜種子以及嫁接砧木葫蘆種子和南瓜種子均發(fā)現(xiàn)攜帶有細(xì)菌性果斑病菌。因此，必須加強(qiáng)對(duì)育種、制種基地的檢疫監(jiān)管，加大對(duì)有關(guān)技術(shù)人員和西瓜育苗戶的西瓜甜瓜細(xì)菌性果斑病防控技術(shù)培訓(xùn)力度，并做好種子消毒等處理措施，從源頭上切斷病害的傳播，確保廣西葫蘆科作物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。本試驗(yàn)選用的銅制劑為生產(chǎn)中使用較為普遍的殺菌劑，結(jié)果顯示這些銅制劑對(duì)該病害均無防治效果，生產(chǎn)上要注意防止菌株產(chǎn)生抗藥性，應(yīng)輪換使用藥劑。試驗(yàn)獲得的結(jié)果僅是室內(nèi)毒力測(cè)定的初步結(jié)果，實(shí)際田間防治試驗(yàn)正在進(jìn)一步研究中。

4 結(jié) 論

細(xì)菌性果斑病菌在廣西地區(qū)已普遍發(fā)生，為了預(yù)防病害通過帶病種子種苗傳播擴(kuò)散，必須加強(qiáng)對(duì)育種、制種的檢疫管理。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，在防治廣西西瓜、甜瓜細(xì)菌性果斑病時(shí)建議使用1號(hào)殺菌劑和40 %甲醛進(jìn)行種子消毒處理，在發(fā)病初期可以考慮使用殺毒礬等藥劑進(jìn)行防治。