頭針電刺激對急性腦梗死大鼠血小板活化標(biāo)志物CD62P、CD63的影響

張銘銘 楊 杰

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060；2.湖北省第三人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060）

急性腦梗死（ACI）是一個復(fù)雜的缺血性級聯(lián)反應(yīng)過程，嚴(yán)重缺血造成腦組織能量很快耗竭，從而發(fā)生的一系列病理生理變化［1］。有文獻(xiàn)報道ACI引發(fā)的多種復(fù)雜的病理變化包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)及興奮性氨基酸毒性作用等，具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［2］。ACI是繼惡性腫瘤、心肌梗死后又一嚴(yán)重影響人類健康的疾病，從1985年至1991年統(tǒng)計的發(fā)病率為 116～219/100 000，死亡率為 118～143/100 000，其中缺血性腦梗死占發(fā)病率的75%。缺血性腦梗死又分腔隙性腦梗死（40.6%）、動脈血栓性腦梗死（21.5%）、栓塞性腦梗死（7.5%）及其他原因引起的腦梗死或者TIA［3］。以中老年人發(fā)病率較高，幸存者中 30%～50%遺留有不同程度的后遺癥［4］。目前，ACI的發(fā)病率在中國呈上升趨勢，給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。本研究以CD62P、CD63為切入點(diǎn)，通過頭針電刺激干預(yù)大鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血模型，觀察血清中CD62P、CD63表達(dá)的變化及神經(jīng)功能缺損情況，探究頭針電刺激對腦梗死可能的作用機(jī)制，為頭針電刺激早期治療提供重要的理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性Wistar大鼠160只，SPF級，體質(zhì)量 240～280 g，動物許可證號：SCXK（鄂）2008-0005，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供（本實(shí)驗(yàn)遵循國際上廣泛接受的減少、替代、優(yōu)化為主的3R試驗(yàn)動物倫理學(xué)原則）。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、飲水，通風(fēng)、自然光照，10～12只分籠飼養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器 大鼠CD62P、CD63酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，購自武漢博士德生物制品有限公司；10%水合氯醛（鄂藥制字H20111145），實(shí)驗(yàn)室提供；光學(xué)顯微鏡；醫(yī)用水浴箱、酶標(biāo)儀、低溫電冰箱 （型號MDFU74V，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；一端經(jīng)過石蠟制備后的漁線（長度15 mm）；華佗牌一次性無菌針灸針，規(guī)格0.20 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)；KDZ-Ⅱ型電針儀（揚(yáng)州市凱達(dá)醫(yī)療設(shè)備）。

1.3 模型制備 參照Zea Longa改良線栓法［5］制備右側(cè)大腦中動脈阻塞（MCAO）動物模型。術(shù)前準(zhǔn)備及步驟：術(shù)前禁食不禁水24 h，隨后稱質(zhì)量。用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.35 mg/100 g），大鼠完全麻醉后將其固定于操作臺之上，頸部皮膚常規(guī)消毒備皮，沿右頸部正中線切開1.5 cm切口，剪開闊筋膜，顯露右側(cè)胸鎖乳突肌，從胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間向深部分離即達(dá)到頸總動脈鞘，用血管鉗將頸總動脈鞘及皮下組織向兩側(cè)牽開，用玻璃分針小心分離出右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內(nèi)動脈（ICA）；用手術(shù)縫合線結(jié)扎右ECA及CCA近心端，不剪斷ECA，不結(jié)扎翼腭動脈，以動脈夾夾閉ICA；用6號注射器針頭于右CCA結(jié)扎的遠(yuǎn)心端（距CCA分叉處約2～3 mm）刺入，導(dǎo)入栓塞線，松開ICA動脈夾，調(diào)整好插線的角度及方向，栓線經(jīng)CCA順利地進(jìn)入ICA，直至右側(cè)大腦中動脈（MCA）的起始部，稍遇到阻力即停止，長度約20～22 mm，說明線栓頭部進(jìn)入MCA，阻斷血流，用縫合線系住栓塞線；確認(rèn)無出血后逐層縫合，傷口局部消毒。假手術(shù)組除不結(jié)扎插線其余步驟同上。大鼠蘇醒后，有以下表現(xiàn)即表示造模成功：提尾時左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲；右眼Horner征；爬行時向左側(cè)劃圈；左側(cè)肢體的疼痛回縮或消失，就可列入實(shí)驗(yàn)研究［6］。

1.4 干預(yù)方法 所有大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為頭針電刺激組、普通針刺組、假手術(shù)組和模型對照組，4組又分1 d、3 d、7 d和14 d組4個亞組，每組10只大鼠，并用苦味酸標(biāo)記編號。頭針電刺激組及普通針刺組參照華興邦制定的《動物針灸穴位圖譜》［7］，選取大鼠的百會穴及大椎穴，大鼠造模成功24 h后，將其俯臥并固定于操作臺，實(shí)施頭針電刺激及普通針刺治療。具體操作方法：首先常規(guī)皮膚消毒，用0.20 mm×25 mm毫針，取百會向前平刺0.5寸，大椎穴直刺0.5寸，兩穴接入KDZ-Ⅱ型電針儀的正負(fù)兩極，選擇疏密波，留針30 min，刺激時長選為每日1次，每次30 min，普通針刺組除不接電針，其余操作同頭針電刺激組，依據(jù)術(shù)后時間確定治療療程分別為1、3、7、14 d。其余兩組大鼠每天在相同時間固定于操作臺30 min，不進(jìn)行任何干預(yù)，療程與頭針電刺激組相同。各組大鼠干預(yù)期間給予正常飲食，觀察毛發(fā)光澤、活動及大小便等，每周稱重，記錄體質(zhì)量變化。療程結(jié)束后，大鼠禁食過夜，脫臼處死，取大鼠股動脈血，離心，分離血清待測。

1.5 觀察項目 1）采用Bederson神經(jīng)功能缺損評分［8］在1、3、7和14 d干預(yù)前后進(jìn)行評分，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。0分為無神經(jīng)功能缺損；1分為不能完全伸展左側(cè)前肢，左腕、肘、肩關(guān)節(jié)屈曲；2分為左肩部側(cè)推抵抗力下降；3分為活動時向左轉(zhuǎn)圈；4分為不能自發(fā)行走，意識障礙。2）取大鼠股動脈血，用抗凝管進(jìn)行收集，然后用離心機(jī)以2000 r/min的速度離心30 min，用移液槍吸取中間黃衣層置于EP管內(nèi)，然后放入-20℃冰箱中備用。采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清中CD62P、CD63的含量，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清CD62P、CD63表達(dá)比較 見表1。頭針電刺激組、普通針刺組和模型對照組與假手術(shù)組比較，大鼠血清中CD62P、CD63表達(dá)均增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；頭針電刺激組、普通針刺組較模型對照組均能降低CD62P、CD63的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且以頭針電刺激組降低CD62P、CD63顯著（P＜0.01），頭針電刺激組中各治療時間點(diǎn)比較，血清中CD62P、CD63表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。普通針刺組中各時間點(diǎn)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型對照組與假手術(shù)組各時間點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以上結(jié)果說明頭針電刺激能充分抑制腦梗死大鼠CD62P、CD63的表達(dá)，其中以14 d組效果最佳。

表1 各組大鼠血清 CD62P、CD63表達(dá)比較（ng/mL，±s）

表1 各組大鼠血清 CD62P、CD63表達(dá)比較（ng/mL，±s）

與本組治療14 d比較，*P＜0.01；與假手術(shù)組同時期比較，△P＜0.01；與模型對照組同時期比較，▲P＜0.01；與普通針刺組同時期比較，#P＜0.01。 下同

組別 時間 C D 6 2 P C D 6 3頭針電刺激組 治療 1 d 1 8.6 7±2.8 4*△▲# 5 6.6 4±4.3 7*△▲#（n＝1 0） 治療 3 d 1 7.7 2±2.6 6*▲# 5 4.7 1±4.1 8*▲#治療 7 d 1 5.4 6±2.2 8*▲# 5 0.4 7±4.2 5*▲#治療 1 4 d 1 2.8 5±1.7 3*▲# 4 3.8 6±3.8 3*▲#普通針刺組 治療 1 d 1 8.8 9±2.8 6△▲ 5 7.2 3±4.4 5△▲（n＝1 0） 治療 3 d 1 8.1 3±2.8 0▲ 5 6.3 5±4.2 6▲治療 7 d 1 7.2 5±2.5 8▲ 5 3.5 8±4.0 2▲治療 1 4 d 1 4.6 4±2.1 7▲ 5 0.7 4±3.9 0▲模型對照組 治療1 d 1 8.9 2±2.8 4△ 5 6.8 8±4.4 1△（n＝1 0） 治療 3 d 1 8.8 1±2.7 5 5 6.2 2±4.3 8治療 7 d 1 8.0 2±2.5 4 5 5.6 3±5.2 5治療 1 4 d 1 7.3 6±2.3 3 5 3.4 7±4.9 6假手術(shù)組 治療 1 d 1 1.3 1±2.0 7 3 4.2 7±2.6 5（n＝1 0） 治療 3 d 1 1.0 7±1.9 6 3 3.8 4±3.1 7治療 7 d 1 0.8 5±1.7 8 3 3.0 6±2.8 3治療 1 4 d 9.7 9±1.6 5 3 2.5 6±2.9 1

2.2 各組大鼠不同時間點(diǎn)Bederson評分比較 見表2。頭針電刺激組、普通針刺組Bederson評分隨治療時間延長而逐漸降低，模型對照組14 d時略有下降。頭針電刺激組與普通針刺組及模型對照組比較，3 d、7 d及14 d組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明頭針電刺激能顯著改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損情況；頭針電刺激組中各治療時間點(diǎn)評分比較，隨著時間增加，評分降低（P＜0.05）；普通針刺組中各治療時間點(diǎn)評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型對照組與假手術(shù)組各治療時間點(diǎn)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明頭針電刺激時間越長，腦梗死大鼠神經(jīng)功能改善越明顯，且以14 d為最佳。

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)Bederson評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)Bederson評分比較（分，±s）

組 別 n 治療前 治療1 d 治療3 d 治療7 d 治療1 4 d頭針電刺激組 1 0普通針刺組 1 0模型對照組 1 0 3.4 6±0.4 8* 3.4 5±0.4 6*3.0 5±0.5 1*▲3.3 7±0.5 3 3.3 5±0.5 2 3.1 7±0.4 9▲3.4 0±0.4 7 3.4 3±0.4 7 3.4 0±0.4 6 2.6 3±0.4 2*▲ 1.3 8±0.3 6*▲2.9 4±0.4 6▲ 2.4 6±0.4 3▲3.2 6±0.4 8 3.0 9±0.5 0假手術(shù)組 1 0 0 0 0 0 0

3 討 論

CD62P、CD63是血小板活化的2個特異性標(biāo)志物［10］，其中CD62P又稱P選擇素，主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞及ɑ顆粒，是血小板表面的一個富含半胱氨酸、高度糖基化的糖蛋白，屬于選擇素家族黏附分子［11］。在靜止血小板表面平均每個血小板僅表達(dá)700個CD62P分子，如果被活化，血小板內(nèi)α顆粒與質(zhì)膜融合并且釋放，使平均每個血小板表達(dá)11000個CD62P分子，并且介導(dǎo)血小板、內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞間的作用［12］。CD63為血小板溶膜體完整糖膜蛋白，在靜止血小板表面僅有少量表達(dá)。

ACI的發(fā)病是諸多因素共同參與的復(fù)雜過程，在梗死中心區(qū)的缺血缺氧造成了自由基產(chǎn)生、血小板活性因子的釋放、腦水腫等引起腦神經(jīng)元代謝紊亂，大量鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞超載線粒體鈣離子沉著，發(fā)生不可逆性神經(jīng)元死亡［13］。在ACI的發(fā)生發(fā)展過程中，血小板活化使存在于血小板胞質(zhì)內(nèi)的CD62P、CD63迅速遷延到血小板的表面，并且大量表達(dá)，介導(dǎo)并啟動血小板與白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，除引起血栓外，還釋放血管活性物質(zhì)損傷微循環(huán)，阻礙側(cè)支循環(huán)的建立［14］。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道血小板活化在ACI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用［15］。 Metzelaar等認(rèn)為 CD62P、CD63 的表達(dá)需要較強(qiáng)的刺激誘導(dǎo)，與其他活化血小板表面標(biāo)志物相比，不易體外激活，更符合臨床指標(biāo)所需的簡便易行等條件，不易因個體操作的不同而引起較大差異，是2 個可靠指標(biāo)［16］。

目前治療ACI的主要手段為溶栓、抗凝、護(hù)腦以及對癥治療，雖能降低患者的生命風(fēng)險，但是對促進(jìn)患者肢體功能恢復(fù)無顯著作用［17］。頭針電刺激治療作為一種非藥物治療，具有療效顯著、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。古人云“急則用針，緩則用藥”“藥之不及，針之所為”?！夺樉拇蟪伞份d“卒暴中風(fēng)，頂門、百會”“初中風(fēng)跌倒……不省人事，牙關(guān)緊閉，藥水不下，急以三棱針刺手十二井，當(dāng)去惡血……乃起死回生妙訣”。近年來，隨著對急性腦梗死研究的深入，李曉寧等報道針灸可以改善大腦局部血供及神經(jīng)功能，推測電針治療急性腦梗死療效最好并且存在最佳時間窗［18］。張純等報道電刺激能將頭針的療效發(fā)揮最大作用，早期或者超早期頭針電刺激治療，能促進(jìn)腦側(cè)支循環(huán)的建立，改善腦組織的血流量，加強(qiáng)腦細(xì)胞的代償能力，可使缺血受損的神經(jīng)突觸數(shù)目得到恢復(fù)，從而改善運(yùn)動功能，減少或者減輕后遺癥的發(fā)生［19］。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察頭針電刺激對右側(cè)MCAO大鼠血清CD62P和CD63水平、神經(jīng)功能缺損以及最佳治療時間窗的影響，結(jié)果表明頭針電刺激能夠降低CD62P、CD63表達(dá)，且時間越長，腦梗死大鼠神經(jīng)功能改善越明顯，且以14 d為最佳。此為頭針電刺激治療急性腦梗死在分子層面提供了理論基礎(chǔ)。