復(fù)元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠microRNA-503及CCNE1、CDC25A蛋白表達的影響及對促進血管新生的實驗研究*

沈俊逸 方邦江 趙智明 劉春麗 壯雨雯 徐文俊 蔡 輝△

（1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京 210002；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032）

糖尿病引起代謝紊亂并導(dǎo)致毛細血管、大血管的病變，是引發(fā)腦梗死的一個獨立危險因素［1-2］。與非糖尿病腦梗死患者相比，糖尿病急性腦梗死患者的腦部血管狹窄病變支數(shù)更多、程度更嚴(yán)重［3-4］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病影響側(cè)支循環(huán)的建立，當(dāng)糖尿病患者血糖水平升高時，體內(nèi)單核細胞參與的毛細血管或者大血管的形成以及血管重塑的能力顯著減弱［5-9］。微小RNAs（microRNAs）在糖尿病及其血管等并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中具有非常重要的作用［10-12］。microRNA-503是microRNA的一個亞型，其調(diào)控生物機體內(nèi)的各種血管，包括動脈、靜脈血管以及毛細血管的內(nèi)壁內(nèi)皮細胞的生理功能，microRNA-503表達過度時，會導(dǎo)致血管的壞死，抑制血管的新生。而通過上調(diào)細胞周期蛋白E1（CCNE1）和 cell division cycle 25 A（CDC25A），在一定程度上能夠抑制microRNA-503的表達，從而改善各種血管內(nèi)皮細胞的功能，避免了其損傷的發(fā)生，并且能夠幫助微血管網(wǎng)絡(luò)形成，促進血管新生。因此，micro RNA-503核酸的表達水平對糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的治療具有非常重要的參考價值以及臨床意義［13-17］。本研究應(yīng)用中藥復(fù)方復(fù)元醒腦湯干預(yù)糖尿病腦梗死大鼠，觀察其對實驗大鼠缺血腦組織的血管新生及腦部微循環(huán)的影響，以期從microRNA-503調(diào)控途徑闡釋復(fù)元醒腦湯起效的具體機制和作用靶點?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

150只健康雄性 SD 大鼠，體質(zhì)量（250±25）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，動物合格證：SCXK（滬）2011-009。

1.2 試藥與儀器

復(fù)元醒腦湯：人參（另煎）10 g，三七10 g，石菖蒲12 g，水蛭 10 g，益母草 30 g，生南星 15 g，制大黃（后下）9 g。復(fù)元醒腦湯生藥質(zhì)量濃度388 g/L，來自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥劑科。二甲雙胍（西安海欣制藥有限公司，規(guī)格 1.25 mg/250 mg，國藥準(zhǔn)字 H20041400），尼莫地平（江蘇康緣弘道醫(yī)藥有限公司，規(guī)格60 mg，批號H20066423）。鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；TTC染色液（2%）購于上海遠慕生物科技有限公司；蛋白濃度BCA法測定試劑盒購于美國Thermo公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海市碧云天生物技術(shù)有限公司；Actin抗體購于美國Sigma公司；CDC25A抗體購于香港Abcam公司；CCNE1抗體購于美國Millipore公司，引物購于生物工程（上海）股份有限公司。RNA抽提試劑，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Syber Green定量PCR試劑盒購于日本Takara公司。RIPA裂解液，BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海碧云天生物公司。高脂飼料（蛋白質(zhì)21%、碳水化合物20%、脂肪59%）和正常飼料（碳水化合物64%、蛋白質(zhì)23%、脂肪13%）由上海斯萊克實驗動物公司生產(chǎn)。

1.3 造模與分組

150只實驗大鼠按隨機數(shù)字表法均分為5組：空白對照組、假手術(shù)組、模型組、西藥治療組、中藥治療組，每組30只?？瞻讓φ战M喂食正常大鼠飼料；假手術(shù)組、模型組、西藥治療組和中藥治療組的大鼠先腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，美國 Sigma 公司）50 mg/kg，隨后采用高脂肪食物飼養(yǎng)2周，連續(xù)測量1周血糖大于16.6 mmol/L為造模成功。將3/0單股尼龍線，放到肝素鈉中浸泡，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉糖尿病模型大鼠，在頸部正中偏右側(cè)進行豎直切口，剝離出右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）。結(jié)扎ECA起始端和CCA近心端，用眼科剪在CCA遠心端和近心端之間剪一個小口距離頸總動脈分叉5 mm，經(jīng)CCA插入3/0尼龍線至大腦中動脈起始段，深度為（18.5±0.5） mm；維持體溫（37.0±0.5） ℃。用乙醚再次麻醉大鼠于術(shù)后2 h把尼龍線輕輕拔退1 cm，作為再灌注0 h?？瞻讓φ战M不做任何處理。假手術(shù)組插線深度為10 mm，余同實驗組。本實驗中動物處理方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 給藥方法

完成造模后，中藥治療組灌胃復(fù)元醒腦湯10.4g/（kg·d），每日 2次。西藥治療組灌胃二甲雙胍 27 mg/（kg·d），每日 2 次；尼莫地平 2.16 mg/（kg·d），每日 2 次。 空白對照組、假手術(shù)組、模型組均灌胃等量的0.9%氯化鈉注射液。各組連續(xù)灌胃14 d后處死取材。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

10%水合氯醛深度麻醉后，快速對實驗動物進行斷頭，迅速剝離顱骨，小心取出腦組織［18］，10%中性固定液固定腦組織48h，然后進行腦組織脫水、石蠟包埋，最后將組織切成5 μm厚的切片。使用免疫熒光染色（VEGF）觀察腦部微血管，細胞核用DAPI染色。使用正立微循環(huán)觀察系統(tǒng)動態(tài)觀察大鼠鼠腦細靜脈中紅細胞流速、血管管徑、白細胞滾動和黏附、白蛋白漏出等腦部血管微循環(huán)的改變。

1.5.1 腦組織 CDC25A、CCNE1、microRNA-503基因表達水平檢測 采用Real-Time PCR技術(shù)，檢測腦組織CDC25A、CCNE1、microRNA-503基因表達水平。具體引物序列如下。microRNA-503 F：TAGCAGCGGGA ACAGTTC。microRNA-503 microRNA-503 R：GTGCA GGGTCCGAGGT。CDC25A F：GGGAATGAGCAGCCTC TTCTTCDC25AR。ATCTCTACAAACCAGACCAGGG；C CNE1F：ACAGCTAGCGCGGTGTAGCCNE1R：GGACTT GGAACTCAGACCCGGAPDHF：ACTTTGGCATCGTGG AAGGGGAPDHF：TGCAGGGATGATGTTCTGGG。用RNA抽提試劑盒抽提腦組織中的RNA，根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)Syber Green定量PCR試劑盒說明書將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進行定量PCR。PCR條件采用兩步法：98℃ 10 s，58℃20 s，40 次循環(huán)。

1.5.2 腦組織中的CDC25A、CCNE1蛋白表達水平檢測 采用常規(guī)的Western blotting實驗方法［19］檢測腦組織中的CDC25A、CCNE1蛋白表達量。用RIPA裂解液進行組織勻漿，離心后用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，上樣30 μg蛋白/孔，進行SDS-PGAE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，孵育CDC25A和CCNE1抗體，孵育二抗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在Biorad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進行免疫印跡檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)元醒腦湯對各組實驗大鼠腦部微循環(huán)功能的影響

使用正立微循環(huán)儀觀察復(fù)元醒腦湯對腦梗死腦部微循環(huán)的作用?？瞻讓φ战M：紅細胞流速較快、血管管徑比較粗、白細胞滾動正常且沒有黏附，沒有白蛋白漏出。假手術(shù)組：紅細胞流速較慢、血管管徑較細、白細胞滾動慢且有白細胞黏附現(xiàn)象，有白蛋白漏出現(xiàn)象。模型組：紅細胞流速較慢、血管管徑較細、白細胞滾動慢有白細胞黏附現(xiàn)象，有白蛋白漏出現(xiàn)象。西藥治療組：紅細胞流速正常、血管管徑較粗、白細胞滾動正常，少見白細胞黏附現(xiàn)象，白蛋白漏出現(xiàn)象不明顯。中藥治療組：紅細胞流速正常、血管管徑較粗、白細胞滾動正常，少見白細胞黏附現(xiàn)象，白蛋白漏出現(xiàn)象不明顯（圖1）。

圖1 各組腦血管微循環(huán)觀察

2.2 復(fù)元醒腦湯對腦梗死后缺血腦組織部位血管新生的影響

血管的新生需要多種生長因子，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是非常重要的一種，這種生長因子能夠有效地促進內(nèi)皮細胞的生長增殖，在血管新生和血管生成的各個階段發(fā)揮著重要作用，VEGF是血管新生的一個重要指標(biāo)，是血管新生的關(guān)鍵因子。通過對不同組別大鼠腦組織VEGF的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)：空白對照組血管數(shù)量豐富，管壁比較厚，官腔飽滿；假手術(shù)組的管壁較薄，管腔比較粗；模型組血管數(shù)量少，管腔破損嚴(yán)重；西藥治療組的管壁增厚；中藥治療組的管壁增厚，有一定的血管新生現(xiàn)象，管腔增大。以上數(shù)據(jù)提示中藥治療組和西藥治療組均對糖尿病腦梗死組織的血管新生有促進要作用，且中藥治療組優(yōu)于西藥治療組（圖2）。對照組血管數(shù)量豐富管壁比較厚，官腔飽滿；假手術(shù)病組管壁較薄，模型組血管數(shù)量少官腔破損；西藥治療組的管壁增厚，管腔小；中藥治療組的管壁增厚，管腔增大提示中藥治療組對腦血管的功能恢復(fù)有重要作用。

圖2 各組腦血管免疫熒光

2.3 復(fù)元醒腦湯調(diào)控microRNA-503、CCNE1、CDC25A mRNA水平的表達

各組實驗大鼠缺血部位腦組織中抽提RNA，做熒光定量檢測microRNA-503基因的表達量以及CCNE1、CDC25A基因的表達水平，結(jié)果顯示：模型組缺血腦組織中microRNA-503表達明顯上調(diào)；與模型組相比，西藥和中藥治療組大鼠缺血腦組織中microRNA-503的基因表達明顯降低（P＜0.01），中藥治療組和西藥治療組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；相對于模型組，空白對照組和假手術(shù)組的microRNA-503表達量都比較低，空白對照組和假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，中藥治療組和西藥治療組的大鼠缺血腦組織中CCNE1、CDC25A的mRNA表達上調(diào)（P＜0.01），從而反向抑制了microRNA-503的基因表達（表 1）。

表1 不同處理組microRNA-503、CDC25A和CCNE1的相對基因表達量（n=30，±s）

表1 不同處理組microRNA-503、CDC25A和CCNE1的相對基因表達量（n=30，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.01。 下同

基因 空白對照組假手術(shù)組 模型組 西藥治療組中藥治療組m i c r o R N A-5 0 3 1.0 0±0.0 6 C D C 2 5 A 1.0 1±0.1 4 1.2 2±0.0 4 6.7 8±0.8 2*2.1 6±0.2 9△ 1.5 9±0.4 2△1.0 0±0.0 1 0.1 4±0.0 2*0.6 4±0.0 5△ 0.7 5±0.0 4△C C N E 1 1.0 1±0.2 4 1.0 4±0.1 1 0.3 1±0.0 5*0.9 9±0.0 6△ 0.9 9±0.1 2△

2.4 復(fù)元醒腦湯促進CNNE1、CDC25A蛋白水平的表達

除了從RNA水平進行相關(guān)機制的研究，我們也在蛋白表達水平上對細胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白進行了WB檢測，發(fā)現(xiàn)中藥治療組和西藥治療組大鼠缺血腦組織中CCNE1、CDC25A的蛋白表達水平均上調(diào)。以上結(jié)果表明，復(fù)元醒腦湯和西藥治療在對疾病的治療過程中可以通過促進細胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表達，而抑制microRNA-503的表達水平，從而影響了糖尿病腦梗死大鼠缺血腦組織中的血運重建過程（圖3，表2）。

3 討 論

復(fù)元醒腦湯治療糖尿病腦梗死具有良好的臨床效果，我們對作用機制進行了一些相關(guān)的實驗研究，復(fù)元醒腦湯改善了糖尿病腦梗死患者神經(jīng)功能，降低血-腦屏障的通透性，減輕了腦水腫；減輕了胰島素抵抗；復(fù)元醒腦湯還能夠提升腦組織中CXCR4、SDF-1、VEGF的蛋白的表達水平，促進神經(jīng)干細胞的歸巢，促進梗死區(qū)域的神經(jīng)和微血管新生，缺血腦組織血供的改善，有利于神經(jīng)功能的修復(fù)［20-22］。

圖3 各組腦組織CCNE1和CDC25A的蛋白含量表達

表2 各組CDC25A和CCNE1蛋白的灰度掃描值（n=30，±s）

表2 各組CDC25A和CCNE1蛋白的灰度掃描值（n=30，±s）

基因 空白對照組假手術(shù)組 模型組 西藥治療組 中藥治療組C D C 2 5 A 0.3 5±0.0 3 0.4 0±0.0 4 0* 0.0 8±0.0 1△ 0.1 1±0.0 1△C C N E 1 0.6 5±0.0 7 0.5 7±0.0 6 0.2 2±0.0 2*0.7 6±0.0 8△ 0.8 8±0.0 9△

糖尿病并發(fā)腦梗死屬于消渴并發(fā)“中風(fēng)”，消渴以燥熱為標(biāo)、陰虛為本，中風(fēng)主要表現(xiàn)為肝臟和腎臟的陰虛以及氣血阻滯。糖尿病并發(fā)腦梗死的治療應(yīng)以扶持元氣為本，輔以化痰祛瘀、息風(fēng)泄熱、醒腦開竅。自擬復(fù)元醒腦湯（治療糖尿病腦梗死取得了良好臨床療效。方中人參大補元氣為君；生天南星、石菖蒲豁痰瀉濁開竅，益母草、三七、水蛭活血逐瘀；大黃瀉熱涼血以息風(fēng)。

復(fù)元醒腦湯作為一種復(fù)方，其作用機制是多靶點的，對復(fù)元醒腦湯多種作用機制的深入研究有利于更加明確其作用機制。本研究證實，復(fù)元醒腦湯上調(diào)了細胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表達，降低了實驗糖尿病腦梗死大鼠microRNA-503的表達。糖尿病是一種代謝性疾病，表現(xiàn)為胰島素分泌不足和胰島素抵抗，同時血糖過高會造成的血管內(nèi)皮細胞損傷。miRNA-503能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相關(guān)靶基因蛋白質(zhì)的表達的作用，參與體內(nèi)葡萄糖的動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)；miRNA-503可以調(diào)控胰島素的分泌、胰島的發(fā)育、胰島β細胞的增殖與凋亡，從而調(diào)節(jié)糖類代謝。microRNA-503可以調(diào)控體內(nèi)的各種血管生理功能，糖尿病腦梗死的病例狀態(tài)下，microRNA-503的上調(diào)會抑制血管的新生。microRNA-503的下調(diào)不但能降低血糖，還能而改善血管內(nèi)皮細胞的功能，并且能夠幫助微血管網(wǎng)絡(luò)形成，促進血管新生。二甲雙胍是治療2型糖尿病的臨床常用藥物，可促進脂肪組織攝取葡萄糖，使肌肉組織無氧酵解增加，增加葡萄糖的利用，減輕胰島素抵抗，減少葡萄糖經(jīng)消化道吸收。尼莫地平對腦組織受體有高度選擇，容易透過血腦屏障。通過有效地阻止鈣離子進入細胞內(nèi)、抑制平滑肌收縮，達到解除血管痙攣之目的，從而保護了腦神經(jīng)元，穩(wěn)定其功能及增進腦血灌流，改善腦供血，提高對缺氧的耐受力。尼莫地平還能降低紅細胞脆性及血液黏稠度，抑制血小板聚集，抗血栓形成，在適宜劑量下選擇性擴張腦血管，幾乎不影響外周血管。西藥治療組使用二甲雙胍和尼莫地平聯(lián)合用藥，提高了周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表達，顯著降低了microRNA-503的表達，通過微循環(huán)觀察儀檢測，西藥治療后腦缺血部位血管增粗，血流加快，蛋白滲漏減少。VEGF免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)腦梗死大鼠梗死區(qū)域的新生血管的數(shù)量增多，血管的管徑增粗。與西藥治療組相比，中藥治療組腦梗死組織的CCNE1和CDC25A蛋白表達也顯著提高，microRNA-503的表達降低，同時也顯著提高了梗死區(qū)域的腦部微循環(huán)，促進了梗死區(qū)域微血管的再生。這說明中藥治療組和西藥治療組都能通過CCNE1和CDC25A蛋白和micro RNA-503信號通路發(fā)揮治療糖尿病腦梗死的作用。

腦梗死后微循環(huán)水平上的缺血，這種缺血的癥狀可同時啟動多種損傷機制，導(dǎo)致缺血級聯(lián)反應(yīng)，最終造成神經(jīng)元損傷，從而加重相應(yīng)的臨床癥狀。缺血同時還會導(dǎo)致血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細胞的功能失調(diào)和凋亡，引起血管壁的病變。糖尿病發(fā)生后，血糖高血管新生能力下降，腦梗死后局部血氧供應(yīng)降低更加顯著地降低了血管新生的能力。血管新生對于腦梗死后缺血腦組織有重要的意義，新生的血管能吸收部分炎癥因子和減輕腦水腫；同時還能為腦組織提供更多的營養(yǎng)成分，促進腦梗死組織的修復(fù)；腦梗死后充分而有效的側(cè)支循環(huán)能夠發(fā)揮很重要的作用，動脈阻塞后局部組織血液供應(yīng)得到改善，也可以避免靜脈阻塞后局部組織發(fā)生淤血現(xiàn)象。

復(fù)元醒腦湯的作為復(fù)方其作用靶點是多方面的，作用機制也是復(fù)雜的，我們從microRNA-503和CCNE1和CDC25A這條信號通路分析復(fù)元醒腦湯的作用機制，這有助于我們加深對糖尿病腦梗死病理機制的認(rèn)識，同時為糖尿病腦梗死的治療提供了新的思路。