綿羊FGF5基因Exon 3多態(tài)性對(duì)毛用性狀的影響

張立春 ，尹 峰 ，柳儉強(qiáng) ，李夢(mèng)姝 ，3，王春昕 ，曹 陽(yáng) ，樸慶林 ，金海國(guó)，張明新

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，公主嶺 136100；2.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，長(zhǎng)春 750001；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 130021）

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5（Fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5）是FGF家族重要成員之一，在抑制毛囊生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)毛囊周期等方面發(fā)揮著重要的作用［1］。從具有長(zhǎng)毛表型的安哥拉鼠（Angora）到Moja小鼠，遺傳學(xué)研究均證明長(zhǎng)毛表型產(chǎn)生的原因在于基因突變導(dǎo)致FGF5功能缺失所致［1-3］。在包括倉(cāng)鼠［4］、貓［5］、狗［6，7］、兔［8］、驢［9］，羊駝［10］乃至人類［11］中的研究報(bào)道也表明，F(xiàn)GF5基因突變與長(zhǎng)毛表型直接相關(guān)。表達(dá)定位研究表明，F(xiàn)GF5主要表達(dá)于毛囊外根鞘，主要通過(guò)縮短毛囊周期中生長(zhǎng)期來(lái)抑制毛發(fā)生長(zhǎng)［1］。在自然狀態(tài)下，F(xiàn)GF5基因除轉(zhuǎn)錄完整mRNA外，也可通過(guò)可變剪切（Alternative splicing，AS）生成中間缺失的FGF5s片段，F(xiàn)GF5s因缺少FGF關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)抑制FGF5功能促進(jìn)長(zhǎng)毛性狀的產(chǎn)生［5，12］。研究表明，綿羊中同樣存在FGF5和 FGF5s［13-14］，人為異位表達(dá)FGF5s可促進(jìn)羊毛生長(zhǎng)［15］，通過(guò) CRISPR/Cas9 產(chǎn)生FGF5突變體可顯著促進(jìn)綿羊羊毛生長(zhǎng)［16-17］。盡管目前尚未發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下FGF5缺失突變羊個(gè)體的存在，但多個(gè)研究表明，綿羊和山羊群體中FGF5基因存在豐富的基因多態(tài)性［18-19］，且與毛絨性狀存在潛在相關(guān)［20-21］。蘇博美利奴羊是2014年國(guó)內(nèi)多家單位聯(lián)合育成的超細(xì)型綿羊品種，在羊毛性狀，尤其是羊毛細(xì)度方面較東北細(xì)毛羊，甚至是新吉細(xì)毛羊和中國(guó)美利奴羊都有顯著提升。本文以吉林地區(qū)蘇博美利奴羊核心群為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)FGF5基因多態(tài)性，分析其與毛用性狀的相關(guān)性，為全面揭示綿羊毛品質(zhì)構(gòu)成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2個(gè)品種綿羊共224只，其中東北細(xì)毛羊98只，蘇博美利奴羊126只，頸靜脈采血10 mL，肝素抗凝，-20℃低溫保存。

10×Buffer，dNTPs，25 mM MgCl2，TaqDNA 聚合酶 ，DNA Marker購(gòu)于天根生化科技有限公司，DNA凝膠回收試劑盒（Axygen）；PMD18-T Vector（TaKaRa）；測(cè)序反應(yīng)交由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取使用 AxyPrep血液基因組提取試劑盒提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20℃保存。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)綿羊FGF5基因組序列（登錄號(hào)：KJ647161.1），采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Exon 3部分多態(tài)性檢測(cè)引物，引物序列為F：5＇AGAGGGAAGGCTAAACGG3＇，R：5＇AGCGAAACTTGAGTCTGTAT3＇。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 目的片段擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為20 μL：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.0 μL，25 mM MgCl21.6 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，上下游引物（10 mmol/μL）各 0.5 μL，dNTPs（10 mmol/μL）1.5 μL，DNA 模板（50～100 ng/μL）1.0 μL，ddH2O 12.4 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 30 s，57℃復(fù)性 30 s，72℃延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 擴(kuò)增片段測(cè)序采用 AXYGEN膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，后連接到pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂于Amp+抗性LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定后送生物公司測(cè)序檢驗(yàn)是否為目的片段。

1.2.5 PCR-SSCP分析 2.5 μL PCR產(chǎn)物與7.5 μL上樣緩沖液［成分同測(cè)序緩沖液：98%去離子甲酰胺、0.025%二甲苯菁、0.025%溴酚藍(lán)、10 mmol/L EDTA（pH 值8.0）、10%甘油］混合后PCR儀99℃變性10 min，變性后迅速插入冰中10 min保持變性狀態(tài)。14%非變性聚丙烯酰胺凝膠過(guò)夜電泳，電泳結(jié)束后銀染顯色。

1.2.6 多態(tài)性片段測(cè)序 通過(guò)以上方法檢測(cè)到的SNP，對(duì)其不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收的目的片段連接轉(zhuǎn)化測(cè)序。

1.2.7 序列分析與數(shù)據(jù)處理 使用DNA Star軟件分析比對(duì)測(cè)序結(jié)果；使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行基因型與羊毛性狀的關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果與分析

以蘇博美利奴羊和東北細(xì)毛羊外周血基因組為模板，基因組PCR結(jié)果顯示，目的條帶接近250 bp，條帶清晰，無(wú)任何非特異性條帶及引物二聚體，可直接用于SSCP檢測(cè)（圖1）。未純化PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)變性、聚丙烯酰胺凝膠及銀染顯色，結(jié)果顯示該片段帶型分散，可輕易辨別不同基因型，按照SSCP命名原則將不同帶型個(gè)體依次命名為 DD、EE、FF、DE 及 EF（圖 2），但在 2個(gè)群體中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DF雜合型個(gè)體的存在。事實(shí)上在東北細(xì)毛羊群體中同樣沒(méi)有檢測(cè)到FF基因型個(gè)體的存在（表1）。純合型個(gè)體目的片段克隆測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域不同基因型是由2個(gè)SNP位點(diǎn)組成，分別為g.20977 A-＞G和 g.21029 G-＞C。其中 g.20977 A，g.21029 G-＞C 構(gòu)成DD、DE、EE基因型。g.21029 G，g.20977 A-＞G構(gòu)成EE、FE、FF基因型。

另外值得關(guān)注的是，本文所檢測(cè)到的2個(gè)突變位點(diǎn)恰好位于綿羊FGF5第3外顯子區(qū)，CDs位置依次為c.618和c.733（圖3），其中c.618突變?yōu)闊o(wú)義突變，但c.733突變引起氨基酸三聯(lián)密碼子CTC-＞GTC突變，導(dǎo)致該位點(diǎn)亮氨酸（L）突變?yōu)槔i氨酸（V），而該突變位點(diǎn)是構(gòu)成E等位基因型的關(guān)鍵所在。

圖1 綿羊FGF5基因組Exon 3區(qū)基因組PCR結(jié)果

圖2 綿羊FGF5基因組Exon 3區(qū)SSCP分型結(jié)果

圖3 綿羊FGF5基因組Exon 3區(qū)不同基因型個(gè)體SNP位點(diǎn)構(gòu)成

進(jìn)一步對(duì)2個(gè)群體羊的不同基因型、等位基因頻率分析發(fā)現(xiàn)，DE和EF基因型在蘇博美利奴羊群體中頻率相對(duì)較高，依次為30%和36%，其他包括EE、DD和FF在內(nèi)的純合型個(gè)體頻率含量相對(duì)較低，僅FF基因型達(dá)到16%；E等位基因頻率最高，F(xiàn)次之，D最低（表1）。東北細(xì)毛羊群體中各基因型頻率分布情況則更為特殊，由于缺乏F等位基因，因此僅檢測(cè)到DD、DE和EE基因型，其中DE基因型在群體中占主導(dǎo)地位，EE和DD基因型頻率則差異不大，并由此推導(dǎo)出D和E等位基因在群體內(nèi)頻率也較為接近（表1）。進(jìn)一步通過(guò)卡方檢驗(yàn)來(lái)分析2個(gè)群體內(nèi)不同基因型頻率之間是否存在Hardy-Weinberg平衡關(guān)系?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P值均遠(yuǎn)小于0.01，提示2個(gè)群體FGF5基因均受到高度的選擇壓力，該結(jié)果與2個(gè)品種羊在品種選育過(guò)程中為提升羊毛性狀進(jìn)行人工選擇干預(yù)的實(shí)際情況相符。

鑒于實(shí)驗(yàn)室目前尚沒(méi)有東北細(xì)毛羊相關(guān)毛用性狀生產(chǎn)數(shù)據(jù)，本文利用SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析方法對(duì)不同蘇博美利奴綿羊個(gè)體FGF5基因Exon 3的基因型與剪毛量、拉伸長(zhǎng)度及纖維直徑的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，不同基因型個(gè)體間羊毛拉伸長(zhǎng)度和纖維直徑并不存在顯著差異性（P＞0.05）（表2），但在剪毛量指標(biāo)上表現(xiàn)為FF基因型個(gè)體顯著高于DD基因型個(gè)體（P＜0.05）。該結(jié)果似乎與其他物種中FGF5基因缺失突變引起長(zhǎng)毛的表型不符，但鑒于一方面綿羊中并未發(fā)現(xiàn)FGF5基因突變型個(gè)體的存在，同時(shí)除提前終止的情況外，基因SNP的產(chǎn)生僅可能對(duì)基因功能產(chǎn)生微調(diào)，并不能起到基因缺失的效果。事實(shí)上不同物種FGF5基因多態(tài)性與毛絨生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析研究也存在不同。有研究證明，絨山羊FGF5基因多態(tài)性與山羊絨長(zhǎng)度密切相關(guān)［20］，但在兔中的研究則存在不同的結(jié)果［8，22］。

表1 綿羊FGF5基因Exon 3區(qū)基因型頻率與等位基因頻率

表2 蘇博美利奴羊FGF5基因Exon 3區(qū)不同基因型與毛用性狀相關(guān)分析

3 討論

蘇博美利奴羊是近年來(lái)國(guó)內(nèi)多家綿羊育種機(jī)構(gòu)歷時(shí)多年聯(lián)合攻關(guān)育成的超細(xì)型綿羊品種，其生產(chǎn)性能在國(guó)內(nèi)，乃至世界均處于較高水平。多項(xiàng)報(bào)道表明，不同物種FGF5基因功能缺失導(dǎo)致長(zhǎng)毛表型，綿羊中人為突變FGF5同樣可產(chǎn)生長(zhǎng)毛表型。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)綿羊FGF5基因自然突變個(gè)體，但研究證明，不同群體綿羊FGF5基因卻存在豐富的基因多態(tài)性。

本試驗(yàn)PCR-SSCP檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘇博美利奴羊和東北細(xì)毛羊群體中共存在5種基因型，2個(gè)群體共計(jì)224只羊中均未發(fā)現(xiàn)DF基因型個(gè)體的存在，其中值得關(guān)注的是東北細(xì)毛羊群體中甚至連F等位基因型個(gè)體也不存在，由此導(dǎo)致FF純合型和EF雜合型個(gè)體均處于缺失狀態(tài)。該結(jié)果與中國(guó)美利奴羊與其他地方綿羊品種FGF5基因Exon 1多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果相類似［18］，提示以毛用性能為主的細(xì)毛羊群體與其他綿羊群體在FGF5基因多態(tài)性上可能存在較大差異。相較于其他綿羊品種，東北細(xì)毛羊是我國(guó)較早育成的半細(xì)毛羊品種，蘇博美利奴羊也是由東北細(xì)毛羊和新吉細(xì)毛羊母本與澳洲美利奴羊父本雜交選育而成，兩者之間存在間接的血緣關(guān)系，東北細(xì)毛羊群體F等位基因缺失的情況似乎無(wú)法解釋，但最可能的原因是F等位基因是澳洲美利奴羊所特有，通過(guò)不斷雜交選育導(dǎo)入到蘇博美利奴羊群體。眾所周知，家畜品種雜交選育過(guò)程需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格并漫長(zhǎng)的后裔測(cè)定，篩選與橫交固定過(guò)程。從2個(gè)群體Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果就可以證實(shí)，2個(gè)群體處于極為嚴(yán)格的選擇壓力之中（表1），由此推測(cè)F等位基因在蘇博美利奴羊群體伴隨著出現(xiàn)及富集的過(guò)程。

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，蘇博美利奴羊群體該區(qū)域FF基因型個(gè)體在剪毛量上顯著高于DD基因型個(gè)體（P＜0.05），而產(chǎn)生FGF5蛋白氨基酸位點(diǎn)突變的E等位基因及其雜合型個(gè)體在所有指標(biāo)中與其他基因型并未呈現(xiàn)顯著性差異（表2）。該結(jié)果似乎與FGF5突變型長(zhǎng)毛性狀相佐，絨山羊中也證明FGF5基因多樣性與絨長(zhǎng)度相關(guān)，但兔中也有證明該基因多態(tài)性與產(chǎn)毛量相關(guān)的報(bào)道［22］。報(bào)道表明，美利奴羊及其雜交群體多性狀QTL定位中關(guān)于產(chǎn)毛量及纖維直徑的BayesR準(zhǔn)確性值最高，相應(yīng)QTL就定位在包括FGF5基因在內(nèi)的控制毛發(fā)生長(zhǎng)的基因座位［21］，提示FGF5還可能參與除毛長(zhǎng)以外的其他性狀構(gòu)成中。為進(jìn)一步明確蘇博美利奴羊FGF5基因多態(tài)性與其產(chǎn)毛性狀的關(guān)系，應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大群體數(shù)量，提高包括毛長(zhǎng)度在內(nèi)的多表性指標(biāo)測(cè)定的準(zhǔn)確性，是未來(lái)進(jìn)一步需要開(kāi)展的工作。當(dāng)然也可以直接采用新一代包括CRISPR/Cas9在內(nèi)的基因編輯技術(shù)，直接制備FGF5突變型綿羊個(gè)體來(lái)獲取毛長(zhǎng)表型，以加快綿羊毛用性狀育種進(jìn)程［16］。