大蔥黃酮的提取工藝及膠囊制備工藝研究

李 肖，周天天 ，蔡 依，鄭吳殷曉 ，盛 芬，阮金蘭

（1.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)院，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430223；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢 430073）

0 引言

大蔥（Allium fistulosum L.），為百合科蔥屬植物，是一種很常見的作物，既是烹調(diào)中的重要香料調(diào)味品，又可作為蔬菜供人們食用，在中國烹飪美食中具有重要的位置，而且在亞洲其他國家和地區(qū)的飲食中，也是一種不可或缺的調(diào)味食材，其食法多樣、營養(yǎng)豐富，既可生食，也能爆炒加工后食用。大蔥不僅具有較高的食用價值，還具有較高的食療作用。大蔥的主要成分有蛋白質(zhì)、維生素、食物纖維、糖，以及鐵、磷、鎂等微量元素[1]，常作為保健食材被廣泛食用。中醫(yī)認(rèn)為，蔥性溫味辛，具有散寒健胃、祛痰、殺菌、利肺通陽、發(fā)汗解表、通乳止血、定痛療傷等功效。大量研究表明，大蔥的醇提物具有抗氧化性、抗菌、降血脂、抗癌、抗肥胖、壯陽等多種作用[2-5]。但是大蔥對人體具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，直接食用很難接受，這極大地限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用價值。許多研究表明大蔥的黃酮成分具有降脂作用，隨著人們生活水平日益提高，高血脂和肥胖疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人們的健康，因此制備一種黃酮膠囊，既可拓展大蔥的藥用價值，又可為高脂患者提供新的選擇，同時也將適當(dāng)掩蔽大蔥直接應(yīng)用時存在的刺激性氣味。由此可見，制備大蔥黃酮膠囊具有顯著意義。試驗(yàn)對大蔥提取進(jìn)行工藝優(yōu)化，為大蔥膠囊制劑制備工藝升級提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

大蔥，購買于武商量販超市，經(jīng)課題組鑒定為大蔥（Allium fistulosum L.），將大蔥洗凈切去蔥葉和根須，只留蔥白，切段后于60℃下烘干至恒質(zhì)量，打粉過40目篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海華振科技有限公司提供；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，以上均為分析純；淀粉、糊精均為試劑級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；3號硬膠囊殼（普魯蘭植物膠囊殼）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

UV-1800型紫外分光光度儀，上海儀電分析有限公司產(chǎn)品；真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、鼓風(fēng)干燥機(jī)、水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；布氏漏斗、普通漏斗、冷凝管、圓底燒瓶（1 L，10 L）、40目篩、200目篩、3號膠囊灌藥模具。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮含量測定

（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取經(jīng)60℃烘干的蘆丁對照品10 mg，用60%乙醇溶解定容至10 mL，蘆丁溶液質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，為母液。精密量取母液0，2.5，5.0，7.0，10.0，12.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入60%乙醇使之成12.5 mL，精密加5%亞硝酸鈉溶液0.75 mL，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁0.75 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉10 mL，加入60%乙醇定容至25 mL，于波長510 nm處測量吸光度，60%乙醇作空白對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

（2）大蔥提取物總黃酮含量測定。準(zhǔn)確稱取大蔥粉末5 g，將用乙醇回流提取的醇溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇后，加入純化水，冷藏過夜沉降去雜，抽濾去雜后經(jīng)純化水定容至50ml，搖勻，取1 mL，按1.2.1（1）中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法配制，于波長510 nm處測吸光度，經(jīng)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線可得總黃酮濃度C?？傸S酮含量計(jì)算公式如下：

式中：C——標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的總黃酮濃度；

m——起始大蔥粉末質(zhì)量。

1.2.2 大蔥提取物浸膏得率測定

準(zhǔn)確稱取大蔥粉末5 g，將用乙醇回流提取的醇溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇后，加入純化水，冷藏過夜沉降去雜，抽濾去雜后經(jīng)純化水定容至50 mL，取5 mL于事先已烘干至恒質(zhì)量玻璃皿中，放入105℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中，烘干至恒質(zhì)量。

大蔥提取物浸膏得率計(jì)算公式如下：

式中：m1——干燥后質(zhì)量，g；

m——起始大蔥粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 大蔥提取物的最佳工藝

（1）單因素試驗(yàn)。①不同料液比對浸膏得率及總黃酮含量的影響。準(zhǔn)確稱取大蔥粉末5 g，分別按料液比為1∶1，1∶5，1∶10，1∶20，1∶30在 80℃下用60%乙醇回流提取2 h，按公式（1） 和（2） 方式計(jì)算總黃酮含量及提取率。②不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對浸膏得率及總黃酮含量的影響。準(zhǔn)確稱取大蔥粉末5 g，分別用乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，45%，60%，75%，90%在80℃下，以料液比為1∶10的比例回流提取2 h，按公式（1） 和（2） 方式計(jì)算總黃酮含量及提取率。③不同回流時間對浸膏得率及總黃酮含量的影響。準(zhǔn)確稱取大蔥粉末5 g，在80℃下用60%乙醇分別回流提取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，按公式（1）和（2） 計(jì)算總黃酮含量及提取率。

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。考查料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對提取工藝的影響，采用L9（34）正交試驗(yàn)對這3個因素進(jìn)行考查。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.4 大蔥提取物硬膠囊的制備

經(jīng)過前期的研究工作，用最佳的大蔥提取物制備工藝制得大蔥提取物，以便進(jìn)一步深入研究與產(chǎn)品開發(fā)將其制成硬膠囊制劑。

（1） 輔料篩選。①輔料的用量，選用3號膠囊，每顆裝提取物粉末0.2 g，制粒100粒，總共需要提取物粉末20 g，按每顆膠囊含總黃酮5 mg計(jì)算，需要總黃酮500 mg，最優(yōu)提取方案提取總黃酮平均含量1.47 mg/g，則需要大蔥粉末354.5 g，最優(yōu)提取方案平均提取率為4.57%，共需提取物16.2 g，需要輔料3.8 g。②膠囊內(nèi)容物的配制，選用淀粉和糊精2種常用輔料，設(shè)計(jì)3種不同處方（見表2），按表2中規(guī)定的量稱取提取干燥后粉末和輔料，混合均勻，過40目篩后過200目篩除去細(xì)粉，放置于真空干燥箱中烘干至恒質(zhì)量。③不同處方膠囊內(nèi)容物的吸濕百分率，將已烘干至恒質(zhì)量的玻璃皿中精密稱取5 g藥粉，平鋪均勻，放置于相對濕度為75%的干燥器內(nèi)，于20℃恒溫下，分別于12，24，48，72 h稱質(zhì)量，按下列公式計(jì)算吸濕百分率。

膠囊內(nèi)容物處方見表2。

表2 膠囊內(nèi)容物處方

式中：m1——每個時間點(diǎn)質(zhì)量，g；

m0——藥物初始質(zhì)量，g。

（2）制粒及干燥。試驗(yàn)以顆粒成型性和粉末量為評價指標(biāo)，對濕潤劑乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行考查。在最佳處方的藥粉中加入適當(dāng)體積分?jǐn)?shù)乙醇拌勻，在60℃中真空干燥過夜，整粒過40目篩除去細(xì)粉，即可。

（3）休止角的測定。采用固定漏斗法進(jìn)行測定，將漏斗放置于距離桌面高度為H的上方，緩慢將顆粒倒入漏斗中，一直到藥粉顆粒堆積到漏斗的下口為止，藥粉堆積成圓錐體，記錄圓錐體底部直徑為2R，由tanα=H/R求得。試驗(yàn)3次，求平均值。

（4）膠囊制備。采用3號膠囊裝入膠囊內(nèi)容物。

（5）大蔥黃酮膠囊質(zhì)量研究。①裝量差異，取大蔥黃酮膠囊12粒，精密稱其質(zhì)量后，仔細(xì)傾出內(nèi)容物，拭凈膠囊殼，再精密稱其膠囊內(nèi)容物質(zhì)量，計(jì)算每粒膠囊內(nèi)容物的裝量和平均裝量。將每粒的裝量與平均裝量相比較，裝量差異限度不多于2粒。②溶出度，以水為溶出介質(zhì)測定大蔥黃酮膠囊的溶出度，測定6顆膠囊溶出度，并計(jì)算平均值。20 min內(nèi)應(yīng)全部溶出。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同料液比對浸膏得率及總黃酮含量的影響

不同料液比對浸膏得率及總黃酮含量的影響見圖2。

由圖2可知，在其他條件不變的情況下，總黃酮含量及浸膏得率隨著料液比增大而增大，在料液比1∶1～1∶10增加明顯，料液比大于1∶10時呈緩慢增長趨勢，也就是在料液比大于1∶10時，再增加乙醇用量對黃酮含量和浸膏得率沒有特別大的優(yōu)勢。出于節(jié)約成本、綠化環(huán)保的原則，因此選擇料液比1∶10，1∶20，1∶30進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對浸膏得率及總黃酮含量的影響

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對浸膏得率及總黃酮含量的影響見圖3。

由圖3可知，在其他條件不變的情況下，總黃酮含量及浸膏得率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時乙醇總黃酮含量最高，此后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，總黃酮含量和浸膏得率呈下降趨勢，其中75%體積分?jǐn)?shù)乙醇黃酮含量和浸膏得率明顯高于其他試驗(yàn)組。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，80%，90%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 不同回流提取時間對浸膏得率及總黃酮含量的影響

不同回流提取時間對浸膏得率及總黃酮含量的影響見圖4。

由圖4可知，在其他條件不變的情況下，總黃酮含量及浸膏得率隨著回流提取時間延長而增大，在回流時間小于2 h的情況下，黃酮含量和浸膏得率均相對較低，高于2 h的回流提取時間黃酮含量和浸膏得率都相對較高，由圖可以看出在2 h之后，雖然顯示回流提取時間越長，黃酮含量和浸膏得率越高，但是其增長趨勢趨于平穩(wěn)，出于節(jié)約時間和能源的原則，因此選擇回流提取時間2，3，4 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

L9（34）正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3L9（34）正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

方差分析結(jié)果見表4。

表4 方差分析結(jié)果

由表4可知，因素A對總黃酮含量和浸膏得率都有顯著影響，因此選擇該因素最好水平A3；B因素對總黃酮含量和浸膏得率都沒有顯著影響，本著節(jié)約溶劑的原則，綜合直觀分析結(jié)果選擇水平B2；C因素對總黃酮含量和浸膏得率都沒有顯著影響，本著節(jié)省時間的原則，綜合直觀分析結(jié)果選擇水平C3。綜合考慮各種影響因素，選擇最佳提取工藝為A2B1C3。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

為進(jìn)一步考查確定的最佳回流提取條件，取3份大蔥粉末按上述回流提取法提取大蔥總黃酮的最佳工藝條件（料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，回流提取4 h） 進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，按公式（1） 和（2） 計(jì)算總黃酮含量及浸膏得率。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 大蔥降脂硬膠囊的制備結(jié)果

2.4.1 輔料篩選結(jié)果

不同處方藥粉的吸濕百分率見表6，不同處方的吸濕百分率見圖5。

表6 不同處方藥粉的吸濕率/%

由表6和圖5可知，與其他處方相比，處方4的吸濕率在各個時間點(diǎn)都相對較低，因此選用處方4的輔料添加處方，即選用淀粉和糊精，可以有效降低藥粉的吸濕性。

2.4.2 潤濕劑乙醇篩選結(jié)果

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對制粒的影響見表7。

表7 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對制粒的影響

由表7可知，90%乙醇作為最佳潤濕劑效果較好，藥粉顆粒易成型，且細(xì)粉較少。因此選用90%乙醇作為最佳潤濕劑。

2.4.3 休止角測定結(jié)果

休止角的測定見表8。

表8 休止角的測定

由表8可知，膠囊內(nèi)容顆粒休止角約為56.58°，表面此藥粉顆粒流動性好，易于分裝。

2.4.4 大蔥黃酮膠囊質(zhì)量研究結(jié)果

（1） 裝量性差異。

裝量性差異結(jié)果見表6。

表6 裝量性差異結(jié)果

由表6可知，裝量差異很小，基本合格。

（2） 溶出度測定。采取3組試驗(yàn)，每組隨機(jī)挑選6顆膠囊測定溶出度，結(jié)果表明，18顆膠囊在人工胃液中均在20 min內(nèi)全部溶出，表明大蔥黃酮膠囊溶出度較好。

3 結(jié)論

經(jīng)過試驗(yàn)研究確定了回流提取制備大蔥提取物的最佳提取工藝，對大蔥提取物進(jìn)行干燥、添加輔料、制劑成型的工藝進(jìn)行了研究，最終建立了大蔥黃酮膠囊制備工藝。

提取工藝的研究中進(jìn)行單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對回流提取黃酮的含量和浸膏得率都有較大影響。以這3個影響因素進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝為料液比1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，回流提取時間4 h。在此最佳工藝條件下，黃酮含量為1.494 mg/g，浸膏得率為4.70%。按照最佳提取工藝大量提取，用純化水除雜后，回收乙醇，在真空干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，稱取16.2 g干燥大蔥粉末，添加淀粉4.9 g，糊精4.9 g，混勻，用90%乙醇作為潤濕劑進(jìn)行濕法制粒，于60℃下真空干燥后制粒，過40目篩和200目篩除去細(xì)粉，濕度低于60%環(huán)境下將藥粉顆粒裝入3號膠囊，制粒100粒，即為大蔥黃酮膠囊。