響應曲面法優(yōu)化菠蘿皮渣多糖的提取及其抗氧化活性研究

杭瑜瑜，秦紫瓊，楊 波

（海南熱帶海洋學院生命科學與生態(tài)學院，海南三亞 572022）

0 引言

多糖具有調(diào)節(jié)免疫[1-2]、抗氧化[3-4]、抗突變[5]、抗腫瘤[6]、降血脂[7]、血糖[8]等多種生理活性，具有良好的應用前景。其提取方法有熱水浸提法、酸提法、減提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和酶解法等。熱水浸提法不需特殊設(shè)備，成本低。菠蘿生產(chǎn)過程中，大量菠蘿皮渣是菠蘿生產(chǎn)和加工的主要副產(chǎn)品，占全部水果質(zhì)量的50%～60%[9]。相關(guān)研究表明，菠蘿皮渣與菠蘿果實中營養(yǎng)成分的種類與比例相差不多。在全球范圍內(nèi)，雖然一些研究是針對菠蘿皮渣開發(fā)與利用的，但是研究成果應用的效果并不是很理想[10]。為了菠蘿皮渣這一加工副產(chǎn)物可以被人們充分利用，試驗以菠蘿皮渣為原料提取菠蘿皮渣中的多糖，并研究其抗氧化活性，可以提高菠蘿皮渣廢棄物的利用率，并增加植物多糖的來源途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料與試劑

菠蘿皮渣：從市場收集新鮮菠蘿皮渣，預處理后備用。

葡萄糖、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、鄰苯三酚、濃鹽酸等，均為分析純。

1.1.2 主要試驗儀器

ML-T型分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；800型電動離心機，金壇市江南儀器廠產(chǎn)品；752N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；101-1AB型電熱鼓風干燥箱，天津賽得利斯實驗分析儀器廠產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菠蘿皮渣中多糖的提取

選取新鮮的菠蘿皮渣，用清水洗干凈后，瀝干水分。將其放入60℃干燥箱干燥12 h，并進行翻動，達到恒質(zhì)量后將其粉碎，過60目篩，置于玻璃容器中密封保存，備用。稱取適量菠蘿皮渣，調(diào)整料液比1∶10，在溫度50℃水浴下處理20 min，待提取液冷卻后抽濾，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min對濾液離心10 min，上清液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/4，加入4倍體積95%的乙醇溶液，于室溫下醇沉12 h，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min沉淀離心20 min后取出，在50℃真空干燥箱干燥24 h，得到菠蘿皮渣粗多糖，稱質(zhì)量。

1.2.2 菠蘿皮渣多糖含量的測定方法

（1）菠蘿皮渣多糖最大吸收波長確定。配制葡萄糖標準溶液，采用硫酸-苯酚法顯色法使葡萄糖標準溶液顯色，再使用紫外-可見分光光度計，于波長190～700 nm處進行光譜掃描，確定最大吸收波長。提取到的菠蘿皮渣多糖也按相同的方法測定，確定最大吸收光譜。

（2） 葡萄糖標準溶液的配制及標準曲線繪制。精確稱取葡萄糖標準品4 mg，溶解于燒杯之中，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容。逐步稀釋后依次得到質(zhì)量濃度為40.0，20.0，10.0，5.0，2.5 mg/L的葡萄糖溶液。各取2 mL溶液與比色管中，分別加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為6%的苯酚水溶液，迅速搖勻，接著立刻加入5 mL濃硫酸，溶液顯色后放入冷水中冷卻[11]，冷卻后，使用分光光度計在最大吸收波長處依次測得不同質(zhì)量濃度葡萄糖標準溶液的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，并標準曲線。得到標準曲線方程為：Y=0.011 5X+0.078 3，R2=0.997 5。

（3）菠蘿皮渣多糖含量的計算。將提取到的菠蘿皮渣多糖溶解于燒杯中，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容后搖勻。按照1.2.2（2）中的顯色方法，于最大吸收波長處測定菠蘿皮渣多糖的吸光度。通過標準曲線公式進行計算，得到所提取的菠蘿皮渣多糖的含量。

（4）菠蘿皮渣多糖提取率的計算。

1.2.3 菠蘿皮渣多糖提取的單因素試驗

分別研究提取溫度、料液比和提取時間對多糖提取率的影響。提取溫度選取50，60，70，80，90℃；料液比選取 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；提取時間選取20，30，40，50，60 min。

1.2.4 菠蘿皮渣多糖提取的響應曲面優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計響應曲面試驗。

因素與水平設(shè)計見表1。

表1 因素與水平設(shè)計

1.2.5 菠蘿皮渣多糖的體外抗氧化活性研究

（1）清除羥自由基活性的測定。參考楊江濤等人[12]的方法進行測定。

（2）清除超氧陰離子活性的測定。參考徐建國等人[13]的方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿皮渣多糖的吸收光譜圖

按照1.2.2（1）的方法，葡萄糖標準品和菠蘿皮渣多糖的光譜掃描圖。

葡萄糖標準品的光譜掃描圖見圖1，菠蘿皮渣多糖樣品的光譜掃描圖見圖2。

從圖中可以看出，葡萄糖標準品于波長489 nm處有最大吸收峰，菠蘿皮渣多糖樣品在相同的波長處有最大吸收。因此，所提取的樣品為多糖。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 提取溫度對菠蘿皮渣多糖提取率的影響

在料液比1∶15，提取時間20 min的條件下，研究不同的提取溫度對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

提取溫度對菠蘿皮渣多糖提取率的影響見圖3。

由圖1可知，當提取溫度低于80℃時，隨著提取溫度的不斷升高，多糖的提取率不斷增大；當提取溫度高于80℃后，隨著提取溫度的不斷升高，多糖提取率開始呈下降趨勢，因此選擇提取溫度80℃較為適宜。

2.麻雀雖小，五臟俱全，對聯(lián)堪稱微作文。要想寫得像，必須按照對聯(lián)特點去寫，“拓展成上句，對應得下聯(lián)”，是為入門法。要想寫得好，必須是“有感而發(fā)，言簡意賅，能耐人尋味?！币驗椋瑢β?lián)也是情感與智慧的結(jié)晶。

2.2.2 料液比對菠蘿皮渣多糖提取率的影響

當提取溫度80℃，提取時間20 min的條件下，研究不同料液比對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

料液比對菠蘿皮渣多糖提取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著浸提液料液比的增大，多糖的提取率先迅速升高，然后又呈現(xiàn)平緩增加趨勢。提取液料液比增大，反應較完全，多糖的擴散速度增快，提取率有所升高；但提取液料液比過大，會給后續(xù)工藝增加難度，并且造成試劑浪費。因此，選擇料液比1∶15較為合適。

2.2.3 提取時間對菠蘿皮渣多糖提取率的影響

在提取溫度80℃，料液比1∶15的條件下，研究不同的提取時間對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

提取時間對菠蘿皮渣多糖提取率的影響見圖5。

由圖5可知，菠蘿皮渣多糖提取率隨著提取時間的延長不斷提高，但在30 min之內(nèi)增長迅速，30 min之后，提取率增長緩慢，變化較小，選擇提取時間30 min較為合適。

2.3 響應曲面試驗結(jié)果與分析

響應曲面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應曲面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

根據(jù)表3的方差分析結(jié)果可知，該模型顯著程度極高（p＜0.000 1）。該模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.991 0，說明99.10%響應值的變化可以用該的模型來解釋，僅僅大約1%不能用這個模型來解釋。因此，用該模型分析熱水浸提法對菠蘿皮渣多糖的提取條件的優(yōu)化研究是非常適宜的。3個單因素對菠蘿皮渣中多糖提取率的影響程度依次為料液比＞提取溫度＞提取時間。

根據(jù)數(shù)學回歸模型得到的數(shù)據(jù)可以分析出，優(yōu)化得到的提取菠蘿皮渣多糖的最佳的提取工藝條件為提取溫度86℃，料液比1∶20，提取時間20 min，在此條件下進行驗證性試驗，菠蘿皮渣多糖的提取率為1.590 3%。

2.4 菠蘿皮渣多糖的體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 清除羥自由基活性的測定結(jié)果

當菠蘿皮渣多糖質(zhì)量濃度為9.1 mg/L時，其對羥自由基的清除作用達31.62%；當質(zhì)量濃度達到18.21 mg/L時，其對羥自由基的清除作用達到36.75%。隨著菠蘿皮渣多糖質(zhì)量濃度的逐漸增高，菠蘿皮渣多糖對羥自由基的清除能力也逐漸增強，由此可以分析出二者之間具有一定的劑量效應關(guān)系[14]。

2.4.2 清除超氧陰離子活性的測定結(jié)果

當菠蘿皮渣多糖的質(zhì)量濃度為9.1 mg/L時，對超氧陰離子的清除作用達27.27%；當質(zhì)量濃度達到36.42 mg/L時，對超氧陰離子的清除作用達到45.45%；當質(zhì)量濃度達到72.83 mg/L時，菠蘿皮渣多糖對超氧陰離子的清除作用可達到50%以上。超氧陰離子可以被菠蘿皮渣多糖快速、有效地清除掉，其清除能力很強。并且其清除能力隨著菠蘿皮渣多糖質(zhì)量濃度的升高而增強，由此可以分析出二者之間的劑量效應關(guān)系較好。

3 結(jié)論

熱水浸提法提取菠蘿皮渣中多糖的工藝條件為提取溫度86℃，料液比1∶20，提取時間20 min，在此條件下進行驗證性試驗，多糖的提取率為1.590 3%。所提取的多糖具有較好的體外抗氧化活性。