南極磷蝦油、魚油與花生四烯酸油對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠脂質(zhì)代謝的影響

白曉琳，薄鈺瑩，丁 寧，王慶慧，韓立華，王靜鳳,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島墨爾文中學(xué)，山東 青島 266106）

骨質(zhì)疏松是一種常見的骨代謝失衡疾病，表現(xiàn)為骨質(zhì)流失、骨微結(jié)構(gòu)損傷和骨髓脂肪增多等。臨床數(shù)據(jù)表明，骨質(zhì)疏松和機(jī)體的脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)。在絕經(jīng)后婦女中，骨密度與總膽固醇、低密度脂蛋白水平呈顯著負(fù)相關(guān)；且大量研究表明，骨質(zhì)減少的患者骨髓脂肪含量高于健康人群。骨髓是唯一的脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞直接相互作用的組織，骨髓脂肪組織位于骨髓腔內(nèi)，在健康成人體內(nèi)占總脂肪比例超過10%，在衰老及骨質(zhì)疏松、糖尿病等許多疾病中具有重要作用。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和花生四烯酸對(duì)于機(jī)體脂質(zhì)代謝具有重要作用。研究表明補(bǔ)充DHA、EPA后，高脂飲食小鼠白色和棕色脂肪組織中的脂質(zhì)積累量降低。二十碳五烯酸磷脂酰膽堿（eicosapentaenoic acid-phosphatidylcholine，EPA-PC）和二十碳五烯酸磷脂酰絲氨酸（eicosapentaenoic acidphosphatidyl serine，EPA-PS）可抑制肝臟脂肪酸合成，通過增強(qiáng)肝臟脂肪酸β氧化改善脂質(zhì)代謝紊亂。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果顯示，適量補(bǔ)充花生四烯酸可降低肝臟脂肪積累，其調(diào)節(jié)脂質(zhì)積累效應(yīng)具有劑量依賴性。不同分子形式的DHA、EPA對(duì)脂質(zhì)代謝的影響不同，常見形式包括乙酯型和甘油三酯型，而關(guān)于磷脂型DHA、EPA的研究相對(duì)較少，且大多數(shù)研究聚焦于DHA、EPA及花生四烯酸單獨(dú)的多不飽和脂肪酸對(duì)于脂質(zhì)代謝的影響，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥脂質(zhì)代謝的研究也鮮見系統(tǒng)報(bào)道。

因此，本研究采用市面上最常見的-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）補(bǔ)充劑，富含乙酯型DHA和EPA的魚油（fish oil，F(xiàn)O），與富含磷脂型DHA和EPA的南極磷蝦油（Antarctic krill oil，AKO）作對(duì)比；并通過最具代表性的-6 PUFA花生四烯酸油（arachidonic acid oil，AAO）作為對(duì)照，探究兩種不同分子形式的DHA、EPA與花生四烯酸對(duì)骨質(zhì)疏松脂質(zhì)代謝的影響，旨在為骨質(zhì)疏松癥患者飲食提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

健康雌性C57BL/6J小鼠，8 周齡，體質(zhì)量（18.0±2.0）g，SPF級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±1）℃，相對(duì)濕度為40%～50%，12 h/12 h明暗交替，實(shí)驗(yàn)期間自由飲食飲水。

AKO（磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60.38%，脂肪酸組成中EPA相對(duì)含量為26.32%、DHA相對(duì)含量為16.64%，比例約為3∶2，EPA與DHA總相對(duì)含量為42.96%）由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品科學(xué)與人類健康實(shí)驗(yàn)室提供；FO（總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.15%，其中，EPA相對(duì)含量為49.29%、DHA相對(duì)含量為32.53%，比例約為3∶2，EPA與DHA總相對(duì)含量為81.82%）購自陜西森朗生物化工有限公司；AAO（基于生物合成技術(shù)獲得的一種-6多不飽和脂肪酸油劑；花生四烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.21%）購自武漢嘉必優(yōu)生物工程有限公司。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒 上海生工生物工程公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 日本TaKaRa公司；熒光染料 瑞士羅氏公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GK99-UNIGAMMA X-RAY PLUS雙能X射線骨密度儀意大利I’CAN公司；YLS-16A小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測定儀濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；BH-2型顯微鏡 日本Olympus公司；RM-2016型石蠟切片機(jī) 徠卡儀器（上海）有限公司；GL-20M型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；Ultra Trurrax T18 basic 型高速勻漿機(jī)德國IKA公司；Model680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；LightCycler480s實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物建模與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

50 只8 周齡健康雌性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)選取10 只小鼠不進(jìn)行去卵巢手術(shù)，但進(jìn)行開腹腔與縫合的假手術(shù)，以其作為假手術(shù)組（Sham），另外40 只進(jìn)行雙側(cè)去卵巢手術(shù)以建立骨質(zhì)疏松癥模型。術(shù)后3 d，將建模成功的小鼠分為模型對(duì)照組（OVX）、南極磷蝦油組（AKO，150 mg/kg）、魚油組（FO，80 mg/kg）、花生四烯酸油組（AAO，140 mg/kg）。假手術(shù)組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水，其余各組按照南極磷蝦油和魚油中DHA、EPA總含量相等且與花生四烯酸含量相等的原則，灌胃相應(yīng)劑量的受試物，灌胃體積為10 mL/kg。受試物干預(yù)12 周，末次給藥，禁食不禁水，稱體質(zhì)量，小鼠摘眼球取血后處死，收集血清離心取上清用于后續(xù)TC、TG濃度測定。迅速剝離左右股骨置于10%中性甲醛溶液中固定，用于骨強(qiáng)度（骨密度、生物力學(xué)性能）測定及骨組織形態(tài)學(xué)觀察。剝離腹腔白色脂肪稱質(zhì)量，體脂比按下式計(jì)算。取肝臟稱總質(zhì)量并取部分肝臟于10%中性甲醛溶液中固定，將剩余肝臟包錫箔紙，放入液氮，于-20 ℃保存，用于后續(xù)TC、TG濃度測定。

1.3.2 骨密度測定

使用雙能X射線骨密度儀在小動(dòng)物模式（電流150 mA、電壓76 kV）下進(jìn)行股骨骨密度測定。

1.3.3 生物力學(xué)性能測定

使用YLS-16A小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測定儀測定股骨骨折斷力。

1.3.4 骨組織形態(tài)學(xué)觀察

股骨于10%中性甲醛溶液固定24 h，并于10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣液中脫鈣2 周后，進(jìn)行石蠟切片（厚度7 μm）。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后于顯微鏡下觀察并拍照。并利用Image J軟件對(duì)相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行分析，具體包括骨小梁厚度、骨小梁分離度和脂肪細(xì)胞數(shù)目。

1.3.5 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

肝臟于10%中性甲醛溶液固定，流水沖洗12 h，利用梯度乙醇脫水后，石蠟包埋切片（厚度6 μm），進(jìn)行HE染色，置于顯微鏡下觀察各組組織形態(tài)。

1.3.6 血清及肝臟中TC、TG水平的測定

按照試劑盒說明書要求，測定小鼠血清及肝臟中TC和TG的水平。

1.3.7 肝臟脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量測定

按照總RNA抽提試劑盒說明書提取肝臟組織mRNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀測定小鼠肝臟中脂質(zhì)合成相關(guān)基因、、、的mRNA相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增45 個(gè)循環(huán)。以作為內(nèi)參基因。目的基因引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of target genes

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）法進(jìn)行組間差異比較，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AKO、FO和AAO對(duì)OVX模型小鼠體質(zhì)量和白色脂肪質(zhì)量的影響

如圖1所示，與Sham組相比，OVX組小鼠體質(zhì)量增加量極顯著升高（＜0.01），且腹腔白色脂肪質(zhì)量與體脂比也極顯著升高（＜0.01）。與OVX組相比，經(jīng)AKO與FO干預(yù)后，小鼠體質(zhì)量增加量極顯著降低，白色脂肪組織質(zhì)量及體脂比極顯著降低；而灌胃AAO組小鼠體質(zhì)量增加量升高了18.74%，白色脂肪質(zhì)量及體脂比均未發(fā)生明顯變化。結(jié)果表明兩種-3 PUFA均能顯著抑制去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)脂肪累積，改善絕經(jīng)后肥胖，AKO效果優(yōu)于FO；而-6 PUFA AAO無此作用。

圖1 AKO、FO和AAO對(duì)OVX小鼠體質(zhì)量增加量（A）、白色脂肪質(zhì)量（B）及體脂比（C）的影響Fig. 1 Effects of AKO, FO and AAO on body mass gain (A), white adipose tissue mass (B) and body fat percentage (C) in OVX mice

2.2 AKO、FO和AAO對(duì)OVX模型小鼠骨強(qiáng)度的影響

骨密度是衡量骨骼強(qiáng)度的一個(gè)黃金指標(biāo)，與骨強(qiáng)度呈正相關(guān)。Byrne等利用骨密度評(píng)判骨質(zhì)疏松癥患者骨折預(yù)后的情況。如圖2A所示，相比于Sham組，OVX組小鼠骨密度顯著降低（＜0.05）。與OVX組相比，經(jīng)AKO與FO干預(yù)后，小鼠骨密度均不同程度地升高，AKO組升高了7.14%（＜0.01），F(xiàn)O組升高了2.78%（＜0.05）；AAO灌胃后小鼠骨密度則極顯著下降（＜0.01）。同時(shí)圖2B顯示，與OVX組相比，經(jīng)AKO與FO干預(yù)后，小鼠骨骼的生物力學(xué)性能得到不同程度的改善，骨折斷力增加，說明抵抗骨折斷的能力增強(qiáng)，而AAO干預(yù)則呈現(xiàn)相反的效果。結(jié)果表明，兩種-3 PUFA均可提高去卵巢小鼠骨強(qiáng)度及生物力學(xué)性能，且AKO效果優(yōu)于FO；而-6 PUFA AAO則降低OVX小鼠骨密度與骨骼生物力學(xué)性能。

圖2 AKO、FO和AAO對(duì)OVX小鼠骨密度（A）與骨折斷力（B）的影響Fig. 2 Effects of AKO, FO and AAO on bone mineral density (A) and fracture (B) in OVX mice

2.3 AKO、FO和AAO對(duì)OVX模型小鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響

骨組織形態(tài)學(xué)能夠直觀地反映骨微結(jié)構(gòu)與骨髓腔脂肪細(xì)胞數(shù)目的情況。如圖3、4所示，OVX組出現(xiàn)了嚴(yán)重的骨微結(jié)構(gòu)破壞，提示骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生；經(jīng)AKO干預(yù)后，OVX小鼠骨小梁顯著變厚，連續(xù)性變好；而AAO干預(yù)會(huì)進(jìn)一步破壞OVX小鼠骨微結(jié)構(gòu)。經(jīng)去卵巢手術(shù)后，相比于Sham組，OVX組脂肪細(xì)胞數(shù)目極顯著增加（＜0.01）。與OVX組相比，AKO與FO干預(yù)后脂肪細(xì)胞數(shù)目極顯著減少，而AAO干預(yù)后脂肪細(xì)胞數(shù)目更多，嚴(yán)重破壞了骨微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，兩種-3 PUFA均可改善骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨微結(jié)構(gòu)損傷，并減少骨髓腔中的脂肪積累，且AKO干預(yù)效果優(yōu)于FO；而-6 PUFA AAO則會(huì)增加骨髓腔中的脂肪細(xì)胞數(shù)目，加劇脂質(zhì)代謝紊亂。

圖3 AKO、FO和AAO對(duì)OVX小鼠骨組織形態(tài)的影響（×200）Fig. 3 Effects of AKO, FO and AAO on bone morphology in OVX mice (× 200)

圖4 AKO、FO和AAO對(duì)OVX小鼠脂肪細(xì)胞數(shù)量（A）、骨小梁厚度（B）及骨小梁分離度（C）的影響Fig. 4 Effects of AKO, FO and AAO on adipocyte number (A),trabecular thickness (B) and trabecular separation (C) in OVX mice

2.4 AKO、FO和AAO對(duì)OVX模型小鼠肝臟的影響

不同組別的肝體比（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）無明顯差異（圖5A），然而，肝臟組織學(xué)結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組小鼠肝臟細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的白色脂滴空泡（圖5B）；經(jīng)AKO與FO干預(yù)后，肝臟細(xì)胞排列整齊、界限分明，脂滴在細(xì)胞質(zhì)中消失，無明顯的脂肪變性，且AKO組肝臟細(xì)胞形態(tài)更接近Sham組；而經(jīng)AAO干預(yù)后，小鼠肝臟細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞中脂滴空泡增加，肝臟脂質(zhì)積累。表明兩種-3 PUFA可改善骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的肝臟脂質(zhì)積累，且AKO干預(yù)效果優(yōu)于FO；而-6 PUFA AAO則進(jìn)一步加劇脂質(zhì)代謝紊亂，促進(jìn)肝臟脂質(zhì)積累。

圖5 AKO、FO和AAO對(duì)OVX小鼠肝體比（A）、肝臟組織形態(tài)學(xué)（B）的影響（×200）Fig. 5 Effects of AKO, FO and AAO on hepatosomatic index (A) and hepatic histomorphology (B) in OVX mice (× 200)

2.5 AKO、FO和AAO對(duì)OVX模型小鼠血清及肝臟脂質(zhì)水平的影響

血清及肝臟中TC、TG的濃度是反映機(jī)體脂質(zhì)水平的重要指標(biāo)。如圖6A所示，相比于Sham組，OVX組血清中TC、TG濃度均顯著升高。與OVX組相比，經(jīng)AKO或FO灌胃后，AKO組血清TC、TG濃度分別顯著下降了9.77%（＜0.01）和11.54%（＜0.05），F(xiàn)O組血清中TC、TG濃度未發(fā)生顯著變化；經(jīng)AAO干預(yù)后，血清中TC、TG濃度分別升高了18.55%（＜0.01）和15.14%（＜0.05）。由圖6B可知，與OVX組相比，經(jīng)AKO與FO干預(yù)后，肝臟TC、TG含量也較OVX組下降，而AAO干預(yù)后則呈升高的趨勢。提示兩種-3 PUFA均能抑制OVX小鼠血脂及肝臟脂質(zhì)水平的升高，且AKO效果更為顯著；而-6 PUFA AAO則促進(jìn)脂質(zhì)水平的上升。

圖6 AKO、FO和AAO對(duì)OVX小鼠血清（A）及肝臟（B）中TC、TG水平的影響Fig. 6 Effects of AKO, FO and AAO on TC and TG levels in the serum (A) and liver (B) of OVX mice

2.6 AKO、FO和AAO對(duì)OVX模型肝臟脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因的影響

由圖7可知，與Sham組相比，OVX組小鼠肝臟中、、和的mRNA表達(dá)水平極顯著升高，表明去卵巢小鼠肝臟中脂質(zhì)合成增加；與OVX組相比，經(jīng)AKO及FO干預(yù)后，小鼠肝臟中脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平顯著或極顯著下降，其中AKO效果整體上更佳；而灌胃AAO后，上述基因表達(dá)水平均不同程度提高，與OVX組相比，、、和的mRNA表達(dá)水平分別升高了31.85%、21.12%、40.71%、18.35%。表明兩種-3 PUFA均有抑制脂質(zhì)合成的作用，且AKO效果優(yōu)于FO；而-6 PUFA AAO則加速了脂質(zhì)在肝臟中的合成。

圖7 AKO、FO和AAO對(duì)OVX小鼠肝臟中脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 7 Effects of AKO, FO and AAO on the mRNA expression of lipid synthesis-related genes in OVX mice

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)去卵巢手術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，比較了AKO、FO和AAO 3 種PUFA油脂對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠脂質(zhì)水平的影響，提示3 PUFA能夠改善骨質(zhì)疏松引起的脂質(zhì)積累，且磷脂型PUFA優(yōu)于乙酯型PUFA，即AKO效果優(yōu)于FO；而-6 PUFA AAO則進(jìn)一步加劇了骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)代謝紊亂。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最為常見的一種骨質(zhì)疏松癥，誘發(fā)原因是體內(nèi)雌激素水平降低。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者常伴有肥胖與白色脂肪組織的過度積累，骨骼強(qiáng)度下降的同時(shí)伴隨著骨髓腔脂肪細(xì)胞數(shù)量增多，成骨細(xì)胞數(shù)量減少；增加的脂肪組織又會(huì)通過釋放炎癥因子來影響骨代謝。本研究中，相比于正常小鼠，OVX小鼠體質(zhì)量明顯上升，腹腔脂肪組織增多，骨髓腔中脂肪細(xì)胞數(shù)目是Sham組的2 倍多。Cho等通過全基因組關(guān)聯(lián)研究證明了骨質(zhì)疏松與肥胖之間密切的聯(lián)系。類似地，采用雙側(cè)卵巢切除建立骨質(zhì)疏松小鼠模型，通過脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，小鼠股骨骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與脂質(zhì)的許多變化有關(guān)，包括脂酰、甘油、甘油磷脂、鞘脂和固醇，表明骨質(zhì)疏松癥確實(shí)誘發(fā)了脂代謝紊亂。因此，骨質(zhì)疏松與脂質(zhì)代謝密不可分，骨質(zhì)疏松的發(fā)生導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，研究骨質(zhì)疏松模型中脂質(zhì)代謝問題具有重要意義。

南極磷蝦油含有豐富的磷脂型-3 PUFA，如磷脂型EPA和磷脂型DHA，有助于改善軟骨結(jié)構(gòu)，抑制軟骨細(xì)胞肥大分化及關(guān)節(jié)軟骨異常凋亡。相比于高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠，添加AKO喂養(yǎng)的小鼠血脂異常得到改善，并能夠顯著降低血清低密度脂蛋白膽固醇含量，從而改善肥胖。本實(shí)驗(yàn)中，AKO的攝入明顯改善了去卵巢導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，進(jìn)一步減少了肝臟、血清中的脂質(zhì)積累。乙酯型FO能夠通過激活軟骨細(xì)胞自噬進(jìn)程來抑制骨性關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨退變進(jìn)程。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)超重和肥胖成人補(bǔ)充乙酯型-3 PUFA，可改善其血脂異常和胰島素抵抗，并改變脂蛋白的脂肪酸組成。本研究使用乙酯型FO緩解了骨質(zhì)疏松小鼠骨強(qiáng)度的降低；同時(shí)這種乙酯型PUFA油脂減少了骨髓腔中脂肪細(xì)胞的數(shù)目，改善了OVX小鼠的血脂異常。分子形式的不同可能影響DHA和EPA在體內(nèi)的吸收和代謝。磷脂形式可使血液中的DHA與EPA維持在較高濃度，而乙酯型的生物利用率低且消化吸收困難。不同分子形式的DHA、EPA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能決定了它們不同的生理功能。

綜上所述，攝入-3 PUFA能夠改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的脂質(zhì)積累，并且磷脂型DHA、EPA效果優(yōu)于乙酯型DHA、EPA；而-6 PUFA的攝入會(huì)加劇脂質(zhì)代謝紊亂，提升骨質(zhì)疏松患者疾病加重的風(fēng)險(xiǎn)。