有關(guān)酶實驗的疑難剖析

河北省灤平縣第一中學(xué)(068250) 王守民

酶是生物體進行各種生化反應(yīng)必不可少的催化劑，絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，少數(shù)酶是RNA。酶具有生物催化作用，其催化作用具有高效性、專一性且需要適宜的條件。關(guān)于酶的實驗設(shè)計是教學(xué)的重點和難點，同時也是高考的高頻考點?；瘜W(xué)反應(yīng)的選擇、試劑的處理、檢測方法的選取、對照實驗的設(shè)置等內(nèi)容對學(xué)生來說較難掌握，也很容易產(chǎn)生疑問。本文就此內(nèi)容進行剖析。

1 酶的化學(xué)本質(zhì)

驗證酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)還是RNA時，實質(zhì)上就是進行蛋白質(zhì)和RNA的鑒定，所以很顯然就要用雙縮脲試劑和吡羅紅染液來進行實驗。即使實驗結(jié)果出現(xiàn)紫色和紅色，也不能說明被測物質(zhì)就是蛋白質(zhì)和RNA，因為沒有已知的蛋白質(zhì)和RNA做對照，來比較兩者的顏色反應(yīng)。所以在實驗時，要注意設(shè)置對照實驗。即選用4支潔凈的試管，編號1、2、3、4。1號至4號試管中分別加入等量的待測酶液、待測酶液已知蛋清稀釋液、RNA液，1號和3號加入適量的雙縮脲試劑，2號和4號加入等量的吡羅紅染液，觀察并記錄4支試管的顏色變化。

2 酶的催化作用及其高效性

2.1 設(shè)計實驗時，要科學(xué)設(shè)置對照實驗

酶的催化作用是指加酶與未加催化劑的實驗相比較得出的；而酶的高效性是指加酶和加入無機催化劑的實驗比較得出的。因此，對照實驗應(yīng)分別設(shè)置加酶和未加催化劑、加酶和加入無機催化劑來進行。

2.2 設(shè)計實驗時，須選擇合適的試劑

驗證酶的催化作用及其高效性時，提供過氧化氫酶的是新鮮的動物肝臟研磨液。實驗時一定要用新鮮的動物肝臟研磨液，因為酶的活性會受溫度影響而使活性下降，也會由于細菌的破壞而使酶的含量減少。

3 酶的專一性

3.1 設(shè)計實驗時，須有科學(xué)的反應(yīng)原理

酶的專一性是指每一種酶只能催化一種或一類化學(xué)反應(yīng)。因此，最好要用淀粉酶分別作用于淀粉和蔗糖來驗證，更符合酶的專一性概念。而用淀粉酶和蔗糖酶分別作用于淀粉實驗，只能說明淀粉酶能水解淀粉，蔗糖酶不能水解淀粉，并不能說明淀粉酶不能水解蔗糖，蔗糖酶能水解蔗糖，不能很好地體現(xiàn)酶的專一性。

3.2 設(shè)計實驗時，要用可靠的檢測方法

淀粉酶催化分解淀粉和蔗糖時，要用斐林試劑進行鑒定，根據(jù)是否有磚紅色沉淀生成來判斷淀粉酶是否對二者都有催化作用，從而探索酶的專一性。實驗中不能用碘液來進行鑒定，因為通過顏色變化能夠檢測淀粉是否水解及水解程度，但無論蔗糖水解與否，都不會和碘液反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，即不能檢測蔗糖的水解。

4 溫度對酶活性的影響

4.1 設(shè)計實驗時，須有科學(xué)的反應(yīng)原理

設(shè)計溫度對酶活性的影響實驗時，應(yīng)該選擇淀粉在淀粉酶催化下的水解反應(yīng)，而不能選用過氧化氫酶催化過氧化氫的分解反應(yīng)。因為過氧化氫的分解反應(yīng)會受到溫度的影響，一般情況下，過氧化氫的分解會隨著溫度的升高而加快。當溫度達到100 ℃時，過氧化氫酶雖已失活，但溫度使反應(yīng)速度加快的程度有可能達到或超過50～60 ℃時酶促反應(yīng)時的反應(yīng)速度。因此，不能得出酶發(fā)揮作用需要適宜溫度的結(jié)論。

4.2 設(shè)計實驗時，應(yīng)有合理的溫度梯度

在設(shè)計溫度對酶活性的影響實驗時，應(yīng)設(shè)置合理的溫度梯度，既要有適宜的溫度，也要有高溫和低溫，而不能只有高溫或只有低溫，最好要有過高、偏高、適宜、偏低和過低等溫度程度。這樣能更好地得出實驗結(jié)果，更好地反映出溫度對酶活性影響的變化趨勢。

4.3 設(shè)計實驗時，試劑的預(yù)設(shè)溫度處理

設(shè)計溫度對酶活性的影響實驗時，正確的操作方法是：取6支潔凈的試管，編號1～6，在1、3、5號試管中均加入2 mL淀粉溶液，在2、4、6號試管中均加入1 mL淀粉酶溶液，將1和4、2和5、3和6試管分為3組，分別置于0 ℃、60 ℃和100 ℃的水浴中保溫5 min，然后將相應(yīng)溫度的淀粉酶溶液加入到淀粉溶液中，混合均勻，仍置于相應(yīng)溫度的水浴中保溫5 min，最后向1、3、5號試管中加入3～4滴碘液，混合均勻后觀察并記錄實驗結(jié)果。這樣做以保證反應(yīng)一開始就達到預(yù)設(shè)的溫度，從而出現(xiàn)正常的實驗現(xiàn)象：1號和5號試管因酶活性低或失活，淀粉不能水解，加入碘液后溶液呈現(xiàn)藍色；3號試管因酶的活性高，淀粉很快被水解掉，因而加入碘液后不變色。

如果只取3支試管，均加入2 mL淀粉或淀粉酶溶液，分別置于0 ℃、60 ℃和100 ℃的水浴中保溫5 min，然后再加入室溫下的淀粉酶溶液或淀粉溶液1 mL，混合均勻，仍置于相應(yīng)溫度的水浴中保溫5 min，最后向3支試管中加入3～4滴碘液，混合均勻后觀察并記錄實驗結(jié)果。這樣做勢必會在混合時，由于溫差導(dǎo)致熱傳遞，就會使所要控制的溫度發(fā)生改變，0 ℃的溶液溫度就會高于0 ℃，60 ℃和100 ℃的溶液溫度就會低于60 ℃和100 ℃，從而使酶的活性發(fā)生改變。因為酶具有高效性，本來不該水解的淀粉發(fā)生了水解，從而影響實驗結(jié)果。1號試管中藍色變淺，2號(熱水中)和3號(沸水中)試管中有相似的顏色變化——不變藍色或呈淺藍色,從而導(dǎo)致實驗失敗, 不能得出低溫抑制酶的活性和高溫使酶失去活性的結(jié)論。

4.4 設(shè)計實驗時，要用可靠的檢測方法

在設(shè)計溫度對酶活性的影響實驗時，要用碘液來檢測淀粉是否水解，而不能選用斐林試劑來進行鑒定。因為溫度對酶活性的影響實驗需要嚴格控制溫度，若使用斐林試劑時檢測需要50～65 ℃水浴加熱，這時就將0 ℃試管中控制的溫度改變?yōu)?0～65 ℃，使酶活性得到恢復(fù)，從而能正常地發(fā)揮催化作用，使0 ℃和60 ℃時的實驗出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

5 pH對酶的活性的影響

5.1 設(shè)計實驗時，須有科學(xué)的反應(yīng)原理

在設(shè)計溫度對酶活性的影響實驗時，應(yīng)該選用過氧化氫的分解反應(yīng)而不能選擇淀粉在淀粉酶催化下的水解反應(yīng)。因為淀粉不僅可以在淀粉酶的催化下水解，也可以在酸的作用下水解。當溶液預(yù)設(shè)pH低于適宜pH時，過低的pH環(huán)境不僅能破壞酶的空間結(jié)構(gòu)使酶失活，從而不能催化淀粉水解。而且在酸性條件下淀粉也可水解，因此不能得出酶發(fā)揮作用需要適宜pH的結(jié)論。

5.2 設(shè)計實驗時，應(yīng)有合理的pH梯度

在設(shè)計pH對酶活性的影響實驗時，應(yīng)設(shè)置合理的pH梯度。既要有適宜pH，也要有高pH和低pH，最好還要有過高pH、偏高pH、適宜pH、偏低pH和過低pH等pH梯度。這樣才能更好地得出實驗結(jié)果，更好地反映出pH對酶活性影響的變化趨勢。

5.3 設(shè)計實驗時，試劑的預(yù)設(shè)pH處理

設(shè)計pH對酶活性的影響實驗時，正確的操作方法是：取7支潔凈的試管，編號1～7，均加入1 mL新鮮的質(zhì)量分數(shù)20%的肝臟研磨液，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)配出不同pH值的溶液，如pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，然后在各支試管中均加入2 mL質(zhì)量分數(shù)3%的過氧化氫溶液，混合均勻后觀察并記錄實驗結(jié)果。這樣做可保證反應(yīng)一開始就達到預(yù)設(shè)的pH值，從而出現(xiàn)正常的實驗現(xiàn)象：4號試管中氧氣產(chǎn)生最快最多，3號和5號、2號和6號試管中因酶活性低，氧氣產(chǎn)生得較慢、較少，1號和7號試管中因酶失去活性，氧氣產(chǎn)生的最慢、最少。這樣設(shè)計實驗?zāi)軌蝮w現(xiàn)溶液pH對酶活性的影響，pH過高或過低都會使酶的活性降低甚至失活。

pH對酶活性的影響實驗，無需像溫度對酶活性的影響實驗?zāi)菢樱矸酆偷矸勖甘孪榷家瑴乇?，然后再同溫混合，因為pH對酶活性的影響不像溫度，溫度過低會抑制酶的活性，使之活性降低，當溫度恢復(fù)適宜的溫度時，酶的活性還可以得到恢復(fù)，能發(fā)揮正常的催化作用。而pH過低或過高，都會破壞酶的空間結(jié)構(gòu)而使之失去活性，不能發(fā)揮催化作用，即使pH恢復(fù)至適宜pH，其活性也不能得以恢復(fù)。實驗時要保證實驗過程中溶液的pH與預(yù)設(shè)的pH一致，從而得出正確的結(jié)論。

總之，在實驗設(shè)計的過程中，要遵循對照性原則、單一變量原則、可操作性原則等，科學(xué)選擇化學(xué)反應(yīng)和實驗材料，合理設(shè)置對照實驗，嚴格控制單一變量，嚴密安排實驗步驟，有效利用可靠的檢測方法對因變量進行檢測，唯此才能獲得可靠可信的實驗結(jié)論。