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    沉默miR156表達的mimicry156載體的構建及轉化煙草的研究

    2015-03-19 13:57:17馮圣軍章玉婷繆家順詹妮朱祝軍于超王華森
    湖北農業(yè)科學 2015年1期
    關鍵詞:轉化

    馮圣軍 章玉婷 繆家順 詹妮 朱祝軍 于超 王華森

    摘要:miR156在植物營養(yǎng)生長階段幼年期向成年期的轉變過程中發(fā)揮重要的調控作用,其通過降解SPLs基因mRNA和翻譯抑制調控靶基因的表達。通過定向改造擬南芥內源性Target mimicry IPS1(INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1)構建了抑制miR156表達的mimicry156載體,并轉化獲得轉基因煙草植株,轉基因植株mimicry156對內源性miR156具有抑制作用。該方法為研究miR156在植物營養(yǎng)生長階段的調控作用提供了方便有效的途徑。

    關鍵詞:miR156;Target mimicry IPS1;表達載體;轉化

    中圖分類號:Q785 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2015)01-0210-05

    miRNA是真核生物中非編碼的小RNA,在基因轉錄后的調控過程中發(fā)揮重要作用,一般位于編碼蛋白質的基因之間,在高等植物編碼蛋白質基因的轉錄產物中存在莖環(huán)(Stem-Loop)結構,經過一系列復雜的加工后,Dicer-Like(DCL)家族基因將莖環(huán)結構中大約21個核苷酸大小的成熟miRNA單鏈切割出來,其可以選擇性地裝載到RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)上,miRNA與靶標RNA進行互補配對,造成靶標RNA的降解或翻譯抑制[1],因而能在轉錄后水平專一性調控靶基因的表達。通常miRNA與其靶基因之間的表達呈負相關,即在組織水平上某個miRNA含量的增加往往伴隨著其靶基因轉錄水平的下降,與轉錄抑制因子相比,miRNA能在轉錄后水平更迅速地調節(jié)靶蛋白質含量,顯著縮短調控反應的延滯期,精確維持靶蛋白質的穩(wěn)定狀態(tài),從而有效地調控植物的生長發(fā)育[2]、生物及非生物的脅迫響應[3]。

    miR156在植物營養(yǎng)生長階段幼年期向成年期轉變過程中發(fā)揮重要的調控作用,其在擬南芥(Arabidopsis thaliana)[4],玉米(Zea mays)[5],苔蘚(Physcomitrella patens)[6]、番茄(Lycopersicon esculentum)[7],夏堇(Torenia fournieri)[8]、軟枝草(Panicum virgatum L.)[9]、水稻(Oryza sativa)[10]等植物中都被證明是營養(yǎng)期轉化的關鍵調控因子。miR156通過降解SPLs基因mRNA并通過翻譯抑制調控靶基因表達,miR156的表達豐度隨著植物發(fā)育進程逐漸降低的同時,解除了對SPLs基因的抑制從而順利調控植物幼年向成年的過渡。

    miR156等microRNA在植物中的重要調節(jié)作用已成為近年來研究的熱點。正向遺傳學研究法通過誘變劑處理,大量篩選突變體研究其表型和生理代謝。但是這種方法隨機性較大,不易獲得目的miRNA功能缺失的突變體,給研究帶來了較大的障礙。靶基因模擬(Target mimicry,TM)技術的出現提供了一種新穎的miRNA研究方法。

    植物中磷的生理平衡受復雜的調控系統(tǒng)支配,從而有效地控制植物的生長[11]。研究發(fā)現miR399、PHO2和IPS1形成反饋循環(huán)系統(tǒng)調節(jié)植物中磷的動態(tài)平衡。在缺磷脅迫下miR399誘導降解與其具有一段互補區(qū)域的PHO2 mRNA,PHO2能夠編碼一種E2泛素結合酶,而這種酶影響植物中磷的含量和再利用過程[12]。除了PHO2 mRNA能夠與miR399互補結合外,研究發(fā)現TPSI基因家族的mRNA同樣含有miR399的結合域,IPS1(INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1)屬于TPSI家族的一員,但與miR399互補配對的IPS1不僅沒有降解反而具有抑制miR399活動的效果[12]。與miR399調節(jié)PHO2的靶位點相比,IPS1在結合域的中心位點有3個核苷酸的插入,相當于miRNA調節(jié)靶基因結合區(qū)域的突起部分,從而阻止了miR399-RISC復合體對IPS1的切割,同時IPS1占據miR399,從而抑制其對靶基因的降解作用[13]。研究發(fā)現,IPS1作用原理同樣可用于抑制其他miRNA的活動[13],本研究通過定向改造擬南芥內源性IPS1構建抑制miR156表達的mimicry156載體,旨在為進一步研究miR156在植物營養(yǎng)階段的調控作用打下基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 材料 擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型(Col-0),煙草(Nicotiana tabacum)(NC89)均為浙江農林大學蔬菜品質改良重點實驗室保存。

    1.1.2 細菌菌株與質粒載體 根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌種GV3101,由pCambia3300改造的具有pUbi10 啟動子的pSY06表達載體,均為本實驗室保存。大腸桿菌(E.coli)菌種Trans5α Chemically Competent Cell,克隆載體 pEASY?誖-Blunt Cloning Kit均購自全式金生物技術有限公司(北京)。

    1.1.3 酶及生化試劑 卡那霉素(Kan)、慶大霉素(Gen)、羧芐青霉素(Carb)和草甘膦(PPT)均購自Sigma 公司。高保真DNA 聚合酶PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase購自于美國NEB(NEW ENGLAND BIOLADS)公司。限制性內切酶SpeⅠ/BamHⅠ、T4 DNA 連接酶及反轉錄試劑盒、定量PCR試劑盒均為Takara公司(大連)產品。質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自生工生物工程股份有限公司(上海)。總RNA 提取試劑盒Trizol購自Invitrogen公司,引物合成、測序由華大基因有限公司完成。endprint

    1.2 方法

    1.2.1 擬南芥IPS1基因克隆 以缺磷培養(yǎng)的擬南芥(Col-0)為材料,依據Trizol試劑盒說明書進行總RNA 的提取,并進行反轉錄得到cDNA。根據IPS1的全長cDNA 序列,利用Primer Premier 5.0 引物設計軟件在編碼區(qū)兩端分別設計擴增引物P1(5′-GGACTAGTATGGGGAGACAACCATGCTG-3′)和P2(5′-CGCGGATCCTCAAAACAACCCAAAAGTGG-3′)。P1引物的5′端加入 BamHⅠ酶切位點,P2引物5′端加入 SpeⅠ酶切位點,以擬南芥cDNA為模板,PCR 擴增IPS1基因。PCR 反應條件為94 ℃ 3 min, 94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35 個循環(huán);72 ℃延伸7 min。將獲得的PCR產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后,切下目的條帶,用膠回收試劑盒回收備用。

    1.2.2 定向改造IPS1基因 定向改造IPS1基因,通過重疊PCR獲得mimicry156目的片段。將IPS1上與miR399 結合的區(qū)域,通過設計特定引物P3(5′-CTTTGACAGAAGATAGAAGTGAGCATTTTCTA

    GAGGGAGATAA-3′)和P4(5′-AAATGCTCACTTCT

    A TCTTCTGTCAAGCTTCGGTTCCCCTCG-3′),改造為miR156與其靶基因結合區(qū)域,通過融合PCR的方法,以上述克隆到的IPS1基因為模板,分別以P1、P3和P4、P2作為引物分段擴增,得到2個克隆片段。然后用這2個片段為模板,以P1和P2為引物,通過融合PCR擴增,產物即為改造好的mimicry 156片段。擴增PCR 反應條件為94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s, 35 個循環(huán);72 ℃ 7 min。融合PCR 反應條件為94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35 個循環(huán);72 ℃ 7 min。將獲得的PCR產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后,切下目的條帶,用膠回收試劑盒回收。

    1.2.3 mimicry156載體的構建 將上述回收得到的目的片段進行定向連接,連接到克隆載體pEASY?誖-Blunt Cloning Kit上,連接產物轉化到感受態(tài)大腸桿菌Trans5α,菌液經PCR和測序驗證。提取陽性克隆質粒經SpeⅠ和BamHⅠ雙酶切后,回收目的片段連入pSY06表達載體中,通過菌液PCR與SpeⅠ和BamHⅠ雙酶切驗證后,采用凍融法轉入農桿菌GV3101中,-80 ℃保存菌株。

    1.2.4 煙草的遺傳轉化與鑒定 利用農桿菌介導的葉盤轉化法轉化煙草NC89[14],通過50 mg/L PPT篩選轉基因抗性植株,并提取T0代煙草轉基因株系進行基因組PCR 鑒定。

    2 結果與分析

    2.1 定向改造IPS1為mimicry156

    Target mimicry通過隔絕miRNA來調控miRNA對靶基因的降解活動,這種作用機制為miRNA的功能研究提供了異于傳統(tǒng)遺傳學且方便有效的途徑。IPS1作為典型的內源性Target mimicry,在缺磷脅迫下與miR399共同維持植物體內磷代謝平衡。根據這種機制本試驗將IPS1定向改造為抑制miR156表達的沉默載體。以缺磷培養(yǎng)的擬南芥cDNA為模板,通過PCR擴增出IPS1基因全長。通過設計特異性引物P3、P4,將IPS1與miR399的結合區(qū)域改造為miR156與其靶基因互補的區(qū)域(圖1),利用重疊延伸的方法,以IPS1的編碼序列為模板進行分段擴增(引物分別為P1、P3和P2、P4)。將2種PCR產物回收并作為模板,以P1和P2為引物進行融合PCR擴增,產物即為mimicry156,圖2為重疊PCR的具體流程示意圖。

    2.2 植物表達載體的構建

    mimicry156片段與pEASY?誖-Blunt Cloning Kit載體連接并轉化到大腸桿菌Trans5α后,如圖3A菌液PCR電泳結果所示,已篩選到了陽性轉化子。測序結果進一步表明,陽性克隆的序列與設計的序列保持一致。用限制性內切酶SpeⅠ和BamHⅠ將質粒和pSY06進行雙酶切,經回收后將目的基因片段插入表達載體pSY06、pUBQ10啟動子的下游,構成mimicry156載體,將構建好的載體分別用SpeⅠ和BamHⅠ雙酶切(圖3B)并進行測序驗證,結果證明mimicry156載體已構建成功。圖3C結果表明,含mimicry156片段的pSY06植物表達載體已成功轉化到農桿菌中。

    2.3 煙草轉mimicry156植株的鑒定

    將構建好的表達載體轉化農桿菌,通過農桿菌介導的葉盤轉化法轉化煙草,獲得轉基因植株,圖4為煙草的遺傳轉化過程。

    為了檢測轉基因是否成功,以野生型和表現出除草劑(Basta)抗性的轉基因煙草植株的基因組DNA為模板,通過bar基因和mimicry156序列設計的特異性引物barF(5′-GCGGTCTGCACCATCGTCAA-3′)、barR(5′-AAACCCACGTCATGCCAGTTCC-3′)和mimiF(5′-TCATGTAAGGAAAGCGTTTTAA-3′)、mimiR(5′-ACTGGTCTGACTATTCTCCAAA-3′)分別進行PCR擴增,鑒定轉基因植株。從圖5中可以看出,轉基因植株基因組中擴增出bar基因和mimicry156片段,而野生型植株中沒有擴增出相應片段,初步判定目的基因已整合到煙草的染色體上。

    2.4 轉基因煙草表型分析

    將上述PCR檢測獲得的8株T0代陽性植株中的9號和34號株系T1代種子和野生型煙草種子播種于無菌土中,經4 ℃破休眠48 h后移入溫室中,此時開始計算植株年齡,待小苗長出子葉后噴施Basta,篩選自交分離含T-DNA的植株,真葉長出后轉基因植株與野生型植株表型逐漸表現出不同(圖6A)。mimicry156植株表現出快速成熟的表型(圖6B):開花明顯提前(圖6C),葉片數量低于野生型植株(圖6D)。相同時間內mimicry156超表達植株葉片發(fā)生速率明顯低于野生型煙草(圖6E)。endprint

    3 討論

    miR156及其靶基因SPLs控制的營養(yǎng)生長階段轉變,被證明與植物一些重要的經濟性狀調控相關,如參與控制植物葉形、葉片大小、葉片發(fā)生速率、葉片擴展率、莖直徑、不定根的發(fā)生、側分支的形成、開花時間、花絮結構等。擬南芥超表達miR156可使幼年蓮座葉數目顯著增多,從而有效增加生物量,為生物能源開發(fā)提供了參考;對園藝作物番茄與觀賞花卉夏堇的研究發(fā)現,miR156對作物株型的修整和果實形狀大小的改變發(fā)揮重要的作用[7,8];能源植物軟枝草過表達miR156顯著提高了葉片數量,為燃料的生產提供資源,同時針對性地表達miR156可提高可溶性糖的含量[9]。研究發(fā)現,miR156在植物多種營養(yǎng)物質合成路徑中發(fā)揮重要的作用,Gou等[15]研究證實miR156活動的增加提高了擬南芥花青素的含量,揭示了花青素、黃酮等次生代謝產物受到miR156-SPLs的調節(jié)。新近研究發(fā)現,光合作用的主要產物—糖,能夠作為一個可移動的信號分子抑制新生葉原基中miR156的表達,從而促進營養(yǎng)生長階段轉變的發(fā)生[16-18]。因此,研究miR156-SPLs在植物中的調控機制具有重要意義。

    傳統(tǒng)的遺傳方法研究miRNA具有很大的局限性,Target mimicry的出現提供了一種全新的調節(jié)特定內源性miRNA表達量的方法。本試驗通過RT-PCR方法克隆了擬南芥IPS1基因,同時定向改造為具有miR156結合位點的抑制miR156表達的mimicry156。為了進一步研究其對miR156的調節(jié)功能,構建了啟動子mimicry156植物表達載體,并將其轉化到煙草中。轉基因植株基因組PCR和Basta檢測表明,mimicry156已經整合到煙草染色體中,轉基因后代與野生型對照相比,其葉片發(fā)生率降低,開花提前,表現出早熟的性狀。上述結果表明,Target mimicry為miR156在植物間保守的調控功能提供了新穎的研究方法,為未來的研究奠定了基礎。

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