丙泊酚對氧糖剝奪導致PC12細胞損傷的保護機制

祁愛花，王愛忠，王 莉

(1.上海健康醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院東院麻醉科 201306； 2.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院麻醉科 200233)

大腦是體內(nèi)對缺氧最敏感的器官之一，圍術期缺氧缺血可能導致神經(jīng)損傷和功能喪失。應激活化蛋白激酶 (SAPK)/Jun 氨基末端激酶 (JNK)被認為是一種應激活化蛋白激酶，可以活化caspase蛋白酶級聯(lián)和激活c-Jun磷酸化，并可作為缺氧缺血性腦損傷的早期標志物[1]。因此，SAPK/JNK信號通路是神經(jīng)藥物保護氧糖剝奪(OGD)損傷細胞的重要靶點。某些藥物(如褪黑素、五味子素A和小檗堿)通過SAPK/JNK信號通路保護OGD損傷的神經(jīng)細胞[2-4]；然而丙泊酚是否可以通過SAPK/JNK信號通路降低OGD導致的細胞凋亡，迄今仍不明確。本文用丙泊酚處理OGD損傷的神經(jīng)元樣鼠嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞，通過觀察細胞活力和蛋白表達，探討丙泊酚對神經(jīng)元樣PC12細胞的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng) PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。將細胞培養(yǎng)在含有5%胎牛血清(Gibco/Life Technologies Ltd.，蘇格蘭)和10%馬血清(Gibco/Life Technologies Ltd.，蘇格蘭)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco/Life Technologies Ltd.，蘇格蘭)中，并將其放在37 ℃恒溫、加濕的培養(yǎng)箱中。神經(jīng)元樣PC12細胞OGD模型：將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并置于具有流入和流出閥門的無氧培養(yǎng)箱(S.E.Barburos Metalicos S.A，西班牙)中，然后將箱內(nèi)注入0.5% O2、5% CO2和95% N2的混合氣體長達48 h。在放入無氧培養(yǎng)箱前1 min，用3種濃度丙泊酚(1、5、10 μmol/L)和10%脂肪乳劑處理細胞。

1.2細胞活力測定 將細胞接種在96孔板中，并通過四基甲偶氮唑藍(MTT)測定細胞活力。細胞在暴露于OGD后1、6、12、24、48 h后，在常規(guī)培養(yǎng)基中于37 ℃下與MTT(100 μg/mL)一起溫育。4 h后，洗滌細胞，然后加入100 μL二甲亞砜(DMSO)溶解。使用酶聯(lián)免疫吸附測定儀(Life Science)在570 nm監(jiān)測產(chǎn)物形成。

1.3cleaved-caspase-3免疫細胞化學染色 處理后的細胞在室溫下用4%多聚甲醛(Sigma，美國)固定20 min，并加入0.1%Triton X-100透化15 min。然后將細胞與cleaved-caspase-3抗體(1∶500，Cell Signaling，Danvers，MA)一起孵育1 h。最后用BX-51熒光顯微鏡(Olympus Corporation，日本)在5個隨機選擇的連續(xù)區(qū)域(5個區(qū)域/組)中計數(shù)的陽性細胞數(shù)目。

1.4Western blot 細胞處理后，4 ℃磷酸鹽緩沖液PBS洗滌并裂解。將總蛋白提取物離心，收集上清液。 使用Bradford蛋白測定法測定蛋白質(zhì)濃度。樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在5%的無脂牛奶中室溫下封閉1 h；在4 ℃下用Bcl-2、cleaved-caspase-3、磷酸化SAPK/JNK和c-Jun的特異性抗體孵育過夜； 并在室溫下與辣根過氧化物酶連接的山羊抗兔免疫球蛋白G孵育1 h。用增強的化學發(fā)光(ECL)檢測蛋白質(zhì)。用Quantity One密度分析軟件(Bio-Rad)定量蛋白質(zhì)條帶。

2 結(jié) 果

2.1PC12細胞形態(tài)變化 PC12細胞在未添加7S-NGF的培養(yǎng)液中，生長緩慢，樹突短，見圖1A；添加7S-NGF的細胞培養(yǎng)液將PC12細胞分化為神經(jīng)元樣細胞株，約95%的細胞新生樹突為細胞體直徑2倍以上，見圖1B。

2.2神經(jīng)元樣 PC12細胞活性變化 神經(jīng)元樣PC12細胞OGD損傷12 h后，觀察到約70%的細胞損傷，見圖2A；OGD+5 μmol/L丙泊酚處理PC12細胞12 h后，細胞活力明顯增加(P<0.05)；OGD+10 μmol/L丙泊酚處理PC12細胞12 h后，細胞活力增加最為顯著(P<0.01)，見圖2B。

2.3神經(jīng)元樣PC12細胞凋亡情況 OGD組凋亡細胞數(shù)高于正常對照組(P<0.01)，OGD+丙泊酚組凋亡細胞數(shù)低于OGD組(P<0.01)，見圖3A、B。OGD組cleaved-caspase-3的表達明顯高于正常對照組(P<0.05)；OGD+丙泊酚組cleaved-caspase-3的表達明顯低于OGD組(P<0.05)，OGD組Bcl-2的表達明顯低于正常對照組(P<0.05)；OGD+丙泊酚組Bcl-2的表達明顯高于OGD組(P<0.05)，見圖3C、D。

A:光鏡下未添加7S-NGF培養(yǎng)的PC12細胞；B:光鏡下添加7S-NGF培養(yǎng)的PC12細胞

A:神經(jīng)元樣PC12細胞OGD損傷；B:藥物處理OGD損傷的神經(jīng)元樣PC12細胞；a：P<0.05，b：P<0.01，c：P<0.001，與0 h組比較；d：P<0.01，e：P<0.05，與OGD組比較

A：免疫細胞化學染色法顯示cleaved-caspase-3陽性細胞；B：隨機選擇的連續(xù)區(qū)域(5個區(qū)域/組)中計數(shù)的陽性細胞數(shù)目；C：Western blot檢測；D：cleaved-caspase-3和Bcl-2蛋白組間比較；a：P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.05,與OGD組比較

2.4細胞磷酸化SAPK/JNK和c-Jun的蛋白表達水平 OGD組磷酸化SAPK/JNK和c-Jun的表達明顯高于正常對照組(P<0.05)；OGD+丙泊酚組磷酸化SAPK/JNK和c-Jun的表達明顯低于OGD組(P<0.05)，見圖4。

A：Western blot檢測；B：phospho-SAPK/JNK和phospho-c-Jun蛋白組間比較；a：P<0.05，b：P<0.01，與正常對照組比較；c：P<0.05，與OGD組比較

3 討 論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)是丙泊酚通過抑制SAPK/JNK-c-Jun信號通路在OGD誘導的PC12細胞損傷過程中發(fā)揮保護作用。

PC12細胞是研究神經(jīng)保護藥物的有效模型[5-6]，本文用添加7S-NGF的細胞培養(yǎng)液分化PC12細胞為神經(jīng)元樣細胞株。95%的細胞新生樹突為細胞體直徑2倍以上，即為分裂后期的神經(jīng)元樣細胞株，用于實驗。本研究結(jié)果表明，神經(jīng)元樣PC12細胞經(jīng)OGD處理后細胞活力明顯降低，呈時間依賴性；損傷12 h后，觀察到約70%的細胞損傷，所以選擇12 h用于實驗。

本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚顯著降低OGD誘導的細胞損傷。SHU等[7]也發(fā)現(xiàn)高劑量丙泊酚可以減少腦梗死體積和腦水腫，該結(jié)果與本文的實驗結(jié)果部分一致。但是，孫茫等[8]研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下丙泊酚可通過氧化應激損傷增加神經(jīng)元樣PC12細胞的凋亡，但其具體機制仍不清楚。所以，又進一步觀察了凋亡蛋白caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能明顯抑制cleaved-caspase-3的水平和增強Bcl-2的表達。本研究也對丙泊酚的溶媒脂肪乳劑效應進行了觀察，發(fā)現(xiàn)等同于最高濃度(10μmol/L)丙泊酚所含的脂肪乳劑沒有明顯降低OGD導致的細胞損傷，說明丙泊酚保護神經(jīng)元樣PC12細胞的效應是藥物本身引起的，與脂肪乳劑無關。

本實驗結(jié)果表明，丙泊酚降低了OGD誘導的磷酸化SAPK/JNK的表達，這與TABAKMAN等[9]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)藥物可以通過SAPK/JNK通路阻止OGD誘導的神經(jīng)元損傷。然而，也有研究報道，藥物保護OGD導致神經(jīng)元的損傷機制可能是阻斷ERK和p38的激活，但不抑制JNK磷酸化[10]。以上研究顯示，不同的藥物對OGD誘導的細胞死亡發(fā)揮不同的保護機制，這些保護機制可能與激活不同轉(zhuǎn)錄因子有關，如激活轉(zhuǎn)錄因子2(ATF2)、Ets和c-Jun及胱天蛋白酶級聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，用OGD+丙泊酚處理的細胞中，磷酸化c-Jun的表達水平低于OGD組。實驗證據(jù)表明，丙泊酚保護神經(jīng)元樣PC12細胞的作用與SAPK/JNK-c-Jun有關。

綜上所述，丙泊酚對OGD導致神經(jīng)元樣PC12細胞損傷的保護作用與SAPK/JNK-c-Jun信號通路有關。這一實驗結(jié)果為進一步分析丙泊酚對缺血缺氧造成的神經(jīng)元損傷的保護作用提供了理論依據(jù)。