響應(yīng)曲面法優(yōu)選香櫞配方顆粒揮發(fā)油包合工藝*

李雪利，高杰，李哲，常云鳳，孫福仁，高晗，李軍山，2（.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北石家莊05430；2.河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，石家莊050200）

香櫞為蕓香科植物枸櫞或香圓的干燥成熟果實(shí)，在秋季果實(shí)成熟時(shí)采收，趁鮮切片，曬干或低溫干燥，亦可整個(gè)或?qū)ζ蕛砂牒髸窀苫虻蜏馗稍颷1]，分布于江蘇、浙江、安徽、江西、湖北、四川等地，多為栽培。香櫞味辛、苦、酸，而性溫，歸脾、肝、肺經(jīng)，化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎，具有疏肝理氣、寬中、化痰等功效，用于肝胃氣滯，胸脅脹痛，脘腹痞滿，嘔吐噫氣，痰多咳嗽。香櫞果實(shí)中含有多種成分，外層果皮含揮發(fā)油，揮發(fā)油中主要成分為枸櫞醛、苧烯、三萜烯等，另含橙皮苷[2]。目前，香櫞配方顆粒生產(chǎn)過(guò)程中揮發(fā)油為手工噴壺加入，該方法存在溶油耗時(shí)、加入不均勻及花粒等問(wèn)題，同時(shí)中間產(chǎn)品儲(chǔ)存過(guò)程中及包裝后隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，揮發(fā)油會(huì)慢慢揮發(fā)而造成損失。為解決香櫞揮發(fā)油加油難及加入后的穩(wěn)定性等問(wèn)題，特展開香櫞揮發(fā)油β-環(huán)糊精（β-CD）包合工藝的探索研究。本研究采用響應(yīng)曲面法，以揮發(fā)油包合率及包合物收率為考察指標(biāo)，以揮發(fā)油與β-CD比例、包合溫度、包合時(shí)間為影響因素，確定香櫞配方顆粒揮發(fā)油包合工藝[3-6]，為工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料 香櫞揮發(fā)油（批號(hào)：170922，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司）、95%乙醇（分析純，批號(hào)：20170218，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司）、β-CD（批號(hào)：160807，安徽山河藥用輔料股份有限公司）。

1.2 主要儀器 EMS-20磁力攪拌水浴鍋（金壇市儀都儀器有限公司）、CPA225D分析天平（賽多利斯）、JMA5002電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）、水循環(huán)真空泵（上海申生科技有限公司）、DHG-9140A熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、太倉(cāng)精宏儀器設(shè)備有限公司）、LC-20AT高效液相色譜儀（島津儀器設(shè)備有限公司），KH3200E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 香櫞配方顆粒揮發(fā)油的提取 取香櫞飲片150kg，加入7倍量的水，保持微沸狀態(tài)水蒸氣蒸餾，提取至揮發(fā)油不再流出，得到油水混合物；將得到的油水混合物放入4℃的冷藏庫(kù)內(nèi)放置24 h，使油水自然分層，分離回收揮發(fā)油層，即得。

1.3.2 香櫞配方顆粒揮發(fā)油包合物的制備 （1）香櫞配方顆粒揮發(fā)油乙醇溶液的制備：取香櫞配方顆粒揮發(fā)油加入等量95%乙醇（V：V）進(jìn)行溶解，混合均勻后備用。（2）β-CD飽和水溶液的制備：稱取各實(shí)驗(yàn)方案中規(guī)定量的β-CD，加入處方量的純化水，在各方案規(guī)定的溫度下制成飽和水溶液，保溫，備用。（3）香櫞配方顆粒揮發(fā)油包合物的制備：將制備好的β-CD飽和水溶液置于EMS-20磁力攪拌水浴鍋內(nèi)，按各實(shí)驗(yàn)方案設(shè)定的包合條件進(jìn)行包合，將香櫞配方顆粒揮發(fā)油乙醇溶液緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，待揮發(fā)油乙醇溶液全部加入后開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)攪拌至規(guī)定時(shí)間，放至室溫，4℃冷藏24 h，抽濾，用無(wú)水乙醇20 mL洗滌3次，置熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，45℃干燥5 h。

1.3.3 包合物收率及揮發(fā)油包合率的測(cè)定 （1）包合物中揮發(fā)油含量測(cè)定。按中國(guó)藥典2015版中揮發(fā)油測(cè)定法甲法，精密稱定上述香櫞揮發(fā)油的干燥包合物，置于燒瓶中，放入沸石適量，加水300 mL，振搖混合后，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸至測(cè)定器中的油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測(cè)定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端達(dá)到刻度0線上面5 mm處為止，放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰好與刻度0線平齊，讀取揮發(fā)油量，計(jì)算供試品中揮發(fā)油含量。（2）揮發(fā)油空白回收率測(cè)定。精密量取揮發(fā)油1.00 mL，β-CD 12 g，在與（1）相同條件下測(cè)定揮發(fā)油的體積，計(jì)算空白回收率。（3）β-CD與純化水比例的影響。稱取β-CD 5 份，各 15 g，分別加入 90、120、150、180、210 g純化水，置磁力攪拌水浴鍋內(nèi)，40℃制成飽和水溶液，將香櫞配方顆粒揮發(fā)油1 mL與95%乙醇溶液1 mL混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，攪拌2 h，放冷，冰箱冷藏24 h，抽濾，用無(wú)水乙醇20 mL洗滌3次，45℃干燥5 h。（4）揮發(fā)油與β-CD比例的影響。同（3）稱取β-CD加入150 g純化水后制成飽和水溶液，分別將香櫞配方顆粒揮發(fā)油 2、1.5、1.2、1、0.75 mL 與等量 95% 乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中后同（3）處理。（5）包合時(shí)間的影響。同（3）稱取 β-CD 加入 150 g純化水后制成飽和水溶液，將香櫞配方顆粒揮發(fā)油1 mL與等量乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中，分別攪拌 1、2、3、4、5 h 后同（3）處理。（6）包合溫度的影響。稱取β-環(huán)糊精5份，各15 g，加入150 g純化水，置磁力攪拌水浴鍋內(nèi)，分別于 30、40、50、60、70℃制成飽和水溶液，將香櫞配方顆粒揮發(fā)油1.5 g與等量乙醇溶液混合均勻，緩慢滴入β-CD飽和水溶液中后同（3）處理。

1.3.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 以揮發(fā)油包合率和包合物收率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，兩個(gè)指標(biāo)的權(quán)重為6：4，揮發(fā)油包合率=包合物實(shí)際含油量/揮發(fā)油空白回收率/投油量×100%，包合物收率=包合物重量/（β-CD重量+投油量）×100%，綜合評(píng)分=（揮發(fā)油包合率/揮發(fā)油包合率最高值）×60+（包合物收率/包合物收率最高值）×40[7-8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用Design-Expert8.0.5軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 揮發(fā)油空白回收率測(cè)定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)3次，其值分別為90.00%、93.00%、92.00%，平均值為91.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.67%。

2.2 單因素考察試驗(yàn)結(jié)果 測(cè)定揮發(fā)油包合率及包合物收率時(shí)，β-CD與純化水比例為1∶10時(shí)綜合評(píng)分最高，見(jiàn)圖1；揮發(fā)油與β-CD比例為1∶15綜合評(píng)分最高，見(jiàn)圖2；包合時(shí)間為4 h，綜合評(píng)分最高，見(jiàn)圖3；包合溫度為40℃時(shí)綜合評(píng)分最高，見(jiàn)圖4。

圖1 β-CD與純化水比例

圖2 揮發(fā)油與β-CD比例

2.3 香櫞配方顆粒揮發(fā)油包合工藝優(yōu)選 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)曲面法對(duì)香櫞配方顆粒揮發(fā)油的β-CD包合工藝進(jìn)行優(yōu)化。以揮發(fā)油與β-CD比例（A）、包合溫度（B）、包合時(shí)間（C）為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表1。

2.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析 本試驗(yàn)共含有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型和方差分析見(jiàn)表3。對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，回歸方程Y=95.78+7.20A-4.68B+2.21C-1.68AB-1.28AC-0.82BC-3.49A2-11.42B2-7.29C2，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)為 0.9927，所建模型與試驗(yàn)擬合較好。該模型具有顯著水平，足以擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)誤差小、可信度高，可以用于香櫞配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合工藝的分析和預(yù)測(cè)。

圖3 包合時(shí)間的影響

圖4 包合溫度的影響

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素水平編碼

2.5 各因素間相互作用對(duì)結(jié)果的影響 由方差分析結(jié)果可以看出，A、B交互效應(yīng)顯著，A、C和B、C交互效應(yīng)不顯著，等高線圖及效應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖5。從綜合評(píng)分考慮各個(gè)因素的影響程度大小為：A＞C＞B。

2.6 響應(yīng)曲面優(yōu)化香櫞配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合工藝條件 最優(yōu)干燥工藝為：揮發(fā)油與β-CD比例為1：16.23；包合溫度為39℃；包合時(shí)間為3.85 h。在此工藝條件下，綜合得分為98.104分。在優(yōu)選出的最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），得到包合物收率為75.64%，揮發(fā)油包合率為90.97%，綜合得分為97.36分，RSD為1.4%。實(shí)踐結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值基本一致。

3 討 論

3.1 本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析對(duì)香櫞配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到揮發(fā)油與β-CD比例、包合溫度、包合時(shí)間對(duì)包合物收率、揮發(fā)油包合率的回歸模型，經(jīng)分析所建模型有效。該方法客觀合理的評(píng)價(jià)了香櫞配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合過(guò)程，避免因主觀因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成誤差，最終確定了最佳包合工藝。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型和方差分析

3.2 由于揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定、易揮散、具有刺激性、溶解性差，故成藥性差，將CD與揮發(fā)油包合后，可增加藥物的穩(wěn)定性、減少揮發(fā)油的揮發(fā)、掩蓋不良?xì)馕丁⒃黾訐]發(fā)油的溶解度[9-14]，利于有效成分的穩(wěn)定和保存[15-19]。因此，CD包合技術(shù)被廣泛用于揮發(fā)油的制劑過(guò)程。但目前CD與揮發(fā)油的包合研究應(yīng)用于中藥配方顆粒尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)香櫞配方顆粒揮發(fā)油β-CD包合工藝進(jìn)行了研究，打破中藥配方顆粒制備過(guò)程中揮發(fā)油傳統(tǒng)的加入方式，增強(qiáng)了藥物的穩(wěn)定性及服藥適應(yīng)性[20]。但改變揮發(fā)油加入方式對(duì)產(chǎn)品藥理作用產(chǎn)生的影響尚待進(jìn)一步研究。

圖5 等高線和響應(yīng)面圖