意大利牛舌草提取物對大鼠離體胸主動脈環(huán)的舒張作用

朱曉東， 張佳佳， 郭玉婷， 蘭 衛(wèi)

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830000； 33新疆醫(yī)科大學(xué)克拉瑪依學(xué)院， 新疆 克拉瑪依 834099)

牛舌草為紫草科植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetiz.)或琉璃苣(BorageofficinalesL.)的地上部分[1],主要含有揮發(fā)油、脂肪酸、三萜類和黃酮類等成分[2],其中，黃酮類化合物包括蕓香苷、異槲皮苷和黃芪苷等，在其新鮮植物體中還分離出抗壞血酸和脫氫抗壞血酸[3]。具有生濕生熱、祛寒補(bǔ)心、潤燥消炎等功效，臨床上多用于心腦血管疾病的治療[4]。近年來，心腦血管疾病是影響人類健康的慢性疾病之一，也逐漸趨于年輕化，除了損害健康以外還會帶來諸多的并發(fā)癥，臨床多采用化學(xué)藥物治療，但副作用較大[5]。徐曉娜等研究發(fā)現(xiàn)牛舌草總黃酮具有抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用并對機(jī)制進(jìn)行了研究[6]。研究表明，意大利牛舌草不同提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒和中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[7-10]。本研究采用立體恒溫灌流系統(tǒng)和壓力換能器研究意大利牛舌草提取物對大鼠主動脈血管的舒張作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物使用許可證號為SCXK(新)2011-0004。

1.2儀器JY96-IIN型超聲提取儀(上海滬析儀器廠)，RE-3000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，CTHI-100B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(施都凱儀器設(shè)備上海有限公司)，BL-420型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.3試劑乙酰膽堿(美國sigma公司，批號20161222，Ach)，去甲腎上腺素(美國sigma公司，批號20161222，PE)， Kreb-Henseleit(K-H)液(NaCl 118mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L,CaCl22.5 mmol/L，glucose 2 g/L， pH 7.4并用雙蒸水定容至1 L)，試劑均為分析純。

1.4藥材意大利牛舌草2017年3月購于新疆維吾爾藥業(yè)有限公司(批號：20161012)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院資源教研室盛萍教授鑒定為紫草科植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetiz)的干燥地上部分。

1.5牛舌草提取物的制備方法稱取意大利牛舌草粗粉 0.5 kg置容器中，加入70%乙醇超聲提取3次，每次40 min，過濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，將濃縮液倒入腎形盤中放于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干成浸膏，使用時(shí)配制成所需濃度。

1.6溶液的制備方法

1.6.1 對照品溶液的制備 將Ach溶于雙蒸水，配制成濃度分別為0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L的溶液。將PE均溶于雙蒸水，配制成濃度為l.0 μmol/L的溶液。

1.6.2 牛舌草提取物溶液的制備 將“1.5”項(xiàng)下牛舌草提取物用1%的DMSO溶液溶解，配制成濃度分別為 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mg/mL的溶液。

1.7大鼠胸主動脈血管環(huán)的制備方法將大鼠脫頸處死后，迅速打開胸腔，剪下腎主動脈以上的胸主動脈，取出后放入已通過氧氣并置于冰育的K-H液中，輕輕甩動將血管中的血液沖出，去除血管上附著的脂肪和結(jié)締組織，將血管環(huán)剪成3 mm長的血管環(huán)，備用。

1.8血管環(huán)的分組及給藥方法隨機(jī)取部分血管環(huán)，用牙簽插入血管環(huán)內(nèi)部來回滾動，去除血管內(nèi)皮細(xì)胞，此為內(nèi)皮去除組；未去除內(nèi)皮的血管環(huán)稱為內(nèi)皮完整組。將血管環(huán)用2個(gè)三角形不銹鋼金屬絲掛起，置于37℃恒溫浴槽中，持續(xù)通入95%的氧氣和5%的二氧化碳混合氣體。主動脈環(huán)的一段連接張力換能器，另一端固定在浴槽中。調(diào)整動脈環(huán)靜息負(fù)荷2 g，用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對血管張力進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)前用60mmol/L的KCl溶液收縮并沖洗2次，收縮活性良好的血管環(huán)用于實(shí)驗(yàn)。

1.9指標(biāo)的測定方法

1.9.1 血管內(nèi)皮功能的檢測 血管環(huán)在浴槽中達(dá)到平衡后，加入終濃度為1.0 μmol/L PE孵育血管環(huán)進(jìn)行預(yù)收縮，待收縮達(dá)到穩(wěn)定，用4個(gè)濃度(0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L)的Ach累積加入浴槽舒張血管環(huán)，待Ach引起的血管環(huán)舒張達(dá)到平衡臺期后，加入1 μmol/L的forskolin 舒張血管環(huán)，待forskolin引起的血管環(huán)舒張為最大舒張狀態(tài)(100%)，舒張率為50%及以上的血管環(huán)為內(nèi)皮完整組，不舒張甚至繼續(xù)收縮的血管環(huán)為內(nèi)皮去除組。

1.9.2 舒張率的測定 內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮去除組更換K-H液平衡45 min(每15 min換液1次)后，加入PE(1 μmol/L)對血管環(huán)進(jìn)行預(yù)收縮，待收縮穩(wěn)定后，逐步累積加入牛舌草提取物，前一個(gè)劑量達(dá)到平衡后再給下一個(gè)劑量，最后加入1 μmol/L的forskolin至最大舒張。舒張率=(血管環(huán)預(yù)收縮最大張力-不同藥物濃度血管環(huán)的張力)/(血管環(huán)預(yù)收縮最大張力-基礎(chǔ)平衡張力)×100%。

2 結(jié)果

2.1大鼠胸主動脈血管環(huán)內(nèi)皮活性檢測內(nèi)皮完整組的最大舒張率Emax為(77.97%±18.92%)，內(nèi)皮去除組為(12.40%±6.37%)，2組大鼠胸主動脈血管環(huán)的內(nèi)皮活性符合實(shí)驗(yàn)要求，均可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見表1。

2.2意大利牛舌草提取物對大鼠胸主動脈環(huán)的舒張作用內(nèi)皮完整組的血管舒張率為(15.13%±3.67%～93.82%±5.35%)，意大利牛舌草醇提物濃度范圍在(1.0～11.0)mg/L內(nèi)具有濃度-劑量效應(yīng)，內(nèi)皮去除組與內(nèi)皮完整組的血管舒張變化情況一致。內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮去除組的Emax分別為(93.82%±5.35%)和(91.54%±5.00%)，內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮去除組的血管舒張作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 Ach對PE預(yù)收縮的主動脈環(huán)的舒張作用/%

表2 牛舌草醇提物對PE預(yù)收縮的主動脈環(huán)的舒張作用/%

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過大鼠離體主動脈環(huán)來檢測意大利牛舌草提取物的舒張血管作用。血管平滑肌的收縮狀態(tài)決定血管腔的大小，血管平滑肌的緊張程度異常增大可以參與血管性疾病的發(fā)生機(jī)制，因此，意大利牛舌草提取物具有舒張血管作用的化合物或中藥提取物對心腦血管等一系列疾病具有積極的作用。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞對血管平滑肌的舒張起著非常重要的作用，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一些一氧化氮(NO)、前列腺素、超極化因子(EDHF)等從而使血管達(dá)到舒張的作用[11]。而PE誘導(dǎo)的血管收縮主要作用在α-腎上腺受體，從而激活磷脂酶C，產(chǎn)生三磷酸肌醇，刺激平滑肌細(xì)胞內(nèi)貯鈣的釋放，同時(shí)也可激活細(xì)胞膜上的操縱性鈣通道(ROC)和磷酸化電壓依賴性鈣通道使細(xì)胞外鈣內(nèi)流而達(dá)到血管收縮的作用[12-13]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，意大利牛舌草對血管具的舒張作用，但對于內(nèi)皮完整組和內(nèi)皮去除組并無性差異，表明牛舌草提取物誘導(dǎo)的舒張作用無內(nèi)皮依賴性，可能是抑制了細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放和細(xì)胞外鈣的內(nèi)流，引起血管環(huán)舒張，從而產(chǎn)生血管舒張的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。