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    準噶爾烏頭中3種生物堿對H9c2細胞的毒性研究

    2018-11-29 08:57:44張麗娟湯興娥姚美琪趙翡翠
    新疆醫(yī)科大學學報 2018年11期
    關鍵詞:堿組準噶爾烏頭

    張麗娟, 湯興娥, 姚美琪, 劉 怡, 趙翡翠

    (新疆醫(yī)科大學第四臨床醫(yī)學院, 烏魯木齊 830000)

    準噶爾烏頭(AconitumsoongoricumStapf.)為毛莨科植物烏頭的干燥塊根[1],主要分布于我國新疆伊犁地區(qū)和阿勒泰地區(qū),生長在海拔 1 800~2 600 m的山地草地和陽坡[2],其主要的化學成分為烏頭堿、雪上一枝蒿乙素、3-脫氧烏頭堿等生物堿[3-5],具有散風寒、除濕、止痛等功效,臨床上多用于風濕類疾病的治療[6]。本課題組前期研究表明新疆準噶爾烏頭的根中含有準噶爾烏頭堿、烏頭堿 、苯甲酰烏頭原堿等化學成分[7-8]。本研究采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法檢測對細胞增殖抑制的作用、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率評價細胞毒性、流式細胞術法檢測細胞的凋亡情況,評價準噶爾烏頭對H9c2細胞的細胞毒性作用,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1細胞H9c2細胞(江蘇凱基生物有限公司,批號JN-3317)。

    1.2儀器Smart CeLL HF-90型CO2細胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司),HF1200LC型生物安全柜(上海力康儀器有限公司),TGL-16GB型臺式低速離心機(上海飛鴿儀器有限公司),DNP-9272型恒溫箱(上海精宏實驗設備有限公司),DHG 型恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司),EcLipse TS100-F型熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司),xMarkTM型酶標儀(美國Bio-Rad公司),DK-80型恒溫水浴鍋(上海精宏儀器廠),YDS-50-125型液氮罐(成都金鳳儀器廠),BCD-249LCK型-20℃低溫冰箱(合肥美菱公司), DW-HL388型-80℃低溫冰箱(合肥美菱公司),Research pLus型手動單道移液器(德國Eppendorf公司)。

    1.3試藥胎牛血清(FBS,上海依科賽生物公司,批號FND500),RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司,批號C11875500BT),0.25%胰酶(法國SANOFI-AVENTIS公司,批號SC40020)(美國GIBCO公司,批號25200-056),PBS磷酸鹽緩沖液粉劑(北京中杉金橋生物公司,批號ZLI-9062),LDH檢測試劑盒(普利萊基因技術有限公司,批號 CK12),青霉素-鏈霉素雙抗(美國GIBCO公司,批號SC30010),CCK8試劑(北京全式金生物公司,批號FC101-03),DMSO(美國SIGMA公司,批號D2650),烏頭堿(成都曼斯特生物技術有限公司,批號A019),準噶爾烏堿、12-表-歐烏堿為實驗室自制。

    1.4方法

    1.4.1 溶液的制備方法 吸取FBS 5 mL,加入青霉素-鏈霉素溶液5 μL,用RPMI 1640培養(yǎng)基定容至50 mL,混勻即得10%FBS完全培養(yǎng)液,4℃保存,備用。分別量取RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO按(6∶3∶1)混勻,即得凍存液。按照說明書配制10% CCK-8溶液。稱取準噶爾烏頭堿、烏頭堿、12-表歐烏頭堿適量,配制成終濃度為200 mg/mL的標準溶液,后續(xù)不同濃度的溶液通過稀釋獲得。

    1.4.2 H9c2細胞的培養(yǎng)方法 取H9c2細胞用含10%FBS和1%青-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),鏡下觀察細胞生長密度,更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng),待細胞生長至對數(shù)生長期后(細胞密度約占10 cm2培養(yǎng)皿面積的80%~90%)進行傳代。超凈臺預先用紫外燈照射30 min,操作過程均保證無菌。用移液器吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液,用無菌PBS溶液沖洗細胞3次后棄去,加入500 μL胰蛋白酶消化,室溫放置3 min于倒置顯微鏡下觀察,輕晃培養(yǎng)皿如有細胞脫落,加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打使細胞完全脫落,放置離心管中1 000 r/min離心3 min,棄上清液,細胞懸液用完全培養(yǎng)基重懸,平均加于2個培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿加入完全培養(yǎng)液8 mL,置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)后換液,根據(jù)細胞狀態(tài)及密度定期進行換液或傳代,計數(shù)接種于不同種類孔板,加藥處理。

    1.4.3 3種烏頭堿對H9c2細胞增殖抑制率的測定方法 將H9c2細胞按“1.4.2”項下培養(yǎng)方法計數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個細胞/孔),每孔加入完全培養(yǎng)基0.1 mL,37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),棄上清液,考察不同藥物濃度(烏頭堿150、250、400、500、1 000 μg/mL,準噶爾烏頭堿100、250、400、600、800、1 000 μg/mL,12-表-歐烏堿100.0、400.0、600.0、800、1 000 μg/mL)的細胞抑制率,每組平行6次,藥物作用24 h后,每孔加入10% CCK-8溶液20 μL,37℃培養(yǎng)2 h,用酶標儀測定450 nm處各組細胞的吸光度A450,計算細胞抑制率??瞻捉M細胞抑制率為0,其他各組細胞抑制率=(1-實驗組A450/對照組A450)×100%。

    1.4.4 3種烏頭堿對H9c2細胞毒性作用的測定方法 將H9c2細胞按“1.4.2”項下方法培養(yǎng),計數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個細胞/孔),實驗分為空白對照組(10%FBS 100 μL/孔),實驗組(烏頭堿組100、400、500 μg/mL,準噶爾烏頭堿組100、400、800 μg/mL, 12-表歐烏頭堿組100、400、800 μg/mL)。每孔加入10%FBS 100 μL, 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌1次,加入完全培養(yǎng)液,進行藥物處理。各組細胞經(jīng)給藥后嚴格按照試劑盒說明書進行操作,計算細胞培養(yǎng)液LDH漏出率[細胞培養(yǎng)液LDH漏出率(%)=培養(yǎng)液LDH總活性/(培養(yǎng)液LDH總活性+細胞勻漿液LDH總活性)×100%,式中培養(yǎng)液LDH總活性=培養(yǎng)液LDH活性×培養(yǎng)液的體積;細胞勻漿液LDH總活性=細胞勻漿液LDH活性×細胞勻漿液蛋白含量×細胞勻漿液LDH體積]。

    1.4.5 3種生物堿對H9c2細胞凋亡的測定方法 將H9c2細胞按 “1.4.2”項下方法培養(yǎng),計數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個細胞/孔),分為空白對照組(10%FBS 100 μL/孔),實驗組(烏頭堿組100、400、500 μg/mL, 準噶爾烏頭堿組100、600、800 μg/mL, 12-表歐烏頭堿組100、400、1 000 μg/mL),每孔加入10%FBS 100 μL,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌1次,用胰酶消化細胞,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,收集細胞,PBS緩沖液輕懸細胞并計數(shù)。 取1×104個細胞,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入200 μL Annexin V-FITC結合液輕懸細胞,再加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,室溫下避光孵育15 min,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入200 mL Annexin V-FITC結合液重懸細胞,然后加入10 μL PI染色液,混勻,避光孵育5 min。細胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾,流式細胞儀檢測,激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm, Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測,PI的紅色熒光通過PI通道(FL2)檢測。使用未經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞作為對照進行熒光補償調節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置,計算細胞凋亡率。

    2 結果

    2.13種生物堿對H9c2細胞的抑制作用結果與空白對照組比較(濃度為0),實驗各組細胞體積變小,隨著時間推移細胞皺縮成橢圓形、球形或其它不規(guī)則形狀,細胞胞體的折光性下降,細胞胞漿內黑褐色沉積斑點增多。藥物干預24 h后,細胞隨藥物濃度的增加逐漸出現(xiàn)死亡脫壁現(xiàn)象,顯微鏡視野中多見無核的細胞殘片(見圖1-3)。 與空白對照組比較,烏頭堿組、準噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組對H9c2細胞的抑制率隨著藥物濃度的增大而升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。烏頭堿組、準噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組IC50值分別為 562.06、726.80、766.11 μg/mL,見表1。

    A: 正常對照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 烏頭堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組

    A: 正常對照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 12-表-歐烏堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組

    A: 正常對照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 準噶爾烏頭堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組

    表1 不同濃度烏頭堿、準噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿對H9c2細胞增殖抑制結果

    注:與空白對照組比較,*P<0.05。

    2.23種生物堿的乳酸脫氫酶(LDH)漏出率實驗結果與空白組比較,烏頭堿組、準噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組對H9c2細胞的細胞LDH漏出率均隨著濃度的增大而升高,且呈一定的劑量依賴性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

    表2 LDH法評價不同濃度烏頭堿、準噶爾烏頭堿、12-表歐烏堿對H9c2細胞的毒性結果

    注: 與空白對照組比較,*P<0.05。

    2.33種生物堿的流式細胞術凋亡實驗的結果與空白對照組比較(濃度為0),在烏頭堿濃度為400 μg/mL、12-表-歐烏堿濃度為400 μg/mL、準噶爾烏頭堿濃度為600 μg/mL以上時,細胞的凋亡差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

    表3 不同濃度烏頭堿、準噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿流式細胞術凋亡實驗的結果

    注:與空白組比較,△P<0.05。

    3 討論

    研究發(fā)現(xiàn)天然藥物具有預防和治療腫瘤的作用,天然藥物已成為最重要的抗腫瘤藥物來源[9-10]。與人體正常組織細胞相比,腫瘤細胞在形態(tài)、組織結構上都有不同程度的差異[11-15]。目前對準噶爾烏頭的化學成分與藥理作用的研究較少,研究方向主要集中在研究其粗提物的藥理活性等方面,對其單體化合物的研究較少。本研究通過對大鼠心肌細胞(H9c2細胞)的細胞毒性研究發(fā)現(xiàn),新疆準噶爾烏頭中準噶爾烏頭堿、烏頭堿與12-表-歐烏堿這3種生物堿對H9c2細胞的增殖具有抑制和促凋亡作用,為抗腫瘤藥物提供了心臟毒性安全性參考資料。

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