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    楊梅素聯(lián)合圍脂滴蛋白對脂肪細(xì)胞脂解的影響*

    2018-11-29 05:42:24張少華王君實董維鵬燕炯
    關(guān)鍵詞:脂滴甘油脂肪

    張少華,王君實,董維鵬,燕炯

    (山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,山西 太原 030001)

    脂代謝紊亂和脂質(zhì)合成分解障礙可致肥胖癥的發(fā)生[1]。脂滴已被證實是一種在脂代謝中起重要作用的細(xì)胞器,主要成分是三酰甘油(triglyceride,TG)和膽固醇酯,脂滴表面有多種功能蛋白[2]。圍脂滴蛋白(perilipin 1, PLIN1)作為PAT家族蛋白的一員,主要定位于脂滴表面,在脂肪分解代謝起屏障保護(hù)作用的一種可磷酸化蛋白[3-5]。短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA, sh-RNA) 是 RNA干 擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)的一種,可有效地降解同源序列的mRNA,進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)[6]。本課題組前期已成功構(gòu)建PLIN1基因的sh-RNA高效干擾載體,并已成功驗證其可有效促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂解作用[7]。

    黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜水果中,具有強(qiáng)抗氧化性、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等生物學(xué)活性[8]。楊梅素(myricetin, Myric)作為黃酮類植物化學(xué)物中比較有代表性的的一種,可以通過降低PLIN1表達(dá)、磷酸化激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL),進(jìn)而加速脂肪分解,降低TG和膽固醇[9-10]。

    本研究擬通過Myric與PLIN1基因sh-RNA高效干擾載體聯(lián)合干預(yù),觀察其對3T3-L1脂肪細(xì)胞脂解效率的影響,并探討其可能機(jī)制,為今后肥胖癥的防治提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料和試劑

    3T3-L1前脂肪細(xì)胞系(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科惠贈,胎牛血清、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶溶液(100 ml)及青鏈霉素混合液(×100)購自武漢Boster生物工程有限公司,TG檢測試劑盒(美國Amresco公司),甘油檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),Myric(上海阿拉丁試劑有限公司),Lipofectamine ? LTX & Plus Reagent(美國Invitrogen公司),PLIN1A抗體、HSL抗體、ATGL抗體和β-Actin抗體購自英國Abcom公司。

    1.2 儀器和設(shè)備

    Eon型微孔板分光光度計(美國Bio-Tek公司),DM3000B型倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司),JY92-Ⅱ型超聲細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝器械研究所),DYCZ-40D型電泳儀(北京六一儀器廠),Neofuge 23R型低溫高速離心機(jī)(上海Heal Force公司)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇﹑培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 從液氮中取出3T3-L1前脂肪細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞長滿時轉(zhuǎn)移到6孔板中。

    采用經(jīng)典“雞尾酒”方法對3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞[11]。在細(xì)胞融合到80%左右時,將完全培養(yǎng)基換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ,2 d后換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)2 d,隨后更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,每2天換液1次,誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞成功后進(jìn)行后續(xù)操作。

    1.3.2 Myric干預(yù)條件的篩選 在3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞第8天后換成含Myric的培養(yǎng)基,分為6組:100、50、10、5、1及0 μmol/L,每組分別干預(yù)48和72 h,檢測TG和甘油含量。

    1.3.3 聯(lián)合干預(yù) 誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞后,Myric聯(lián)合sh-RNA重組干擾載體進(jìn)行干預(yù)實驗,共分4組:聯(lián)合干預(yù)組(Myric+sh-RNA)、轉(zhuǎn)染組(sh-RNA)、Myric組(Myric)和空白組。

    根據(jù)本課題組前期優(yōu)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件,以質(zhì)量體積比為1∶2的方式將質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)脂肪細(xì)胞。轉(zhuǎn)染5 h后,對聯(lián)合組和Myric組換成含有Myric的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h;對轉(zhuǎn)染組和空白組換成正常的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

    1.3.4 脂肪細(xì)胞油紅O染色 聯(lián)合干預(yù)完成后,每孔加入1 ml 4%多聚甲醛溶液,室溫下靜置2 h。用移液管吸掉,加入油紅O工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。1 h后,去離子水沖洗2遍,鏡下觀察并拍照。

    1.3.5 細(xì)胞中TG及甘油含量檢測 Myric干預(yù)后,將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中,冰水浴條件下進(jìn)行超聲破碎,TG試劑盒檢測,于酶標(biāo)儀上546 nm波長處測定TG含量。甘油測定時需將細(xì)胞裂解液放于70℃水浴10 min,滅活脂肪酶,甘油試劑盒檢測,于酶標(biāo)儀550 nm處測定其吸光度,用蛋白濃度對測定值進(jìn)行校正。

    1.3.6 Western blot檢測細(xì)胞中PLIN1A﹑HSL和ATGL蛋白表達(dá) 提取各組蛋白,測定并調(diào)平濃度。制備凝膠,每孔中加50 μg待測樣品,樣品兩端的孔中加入5 μl Marker。80 V跑濃縮膠,120 V跑分離膠,220 mA恒定電流進(jìn)行濕式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,封閉2 h。用封閉液對一抗進(jìn)行稀釋,4℃過夜。二抗孵育時37℃搖床70 min。取出條帶,加入ECL發(fā)光工作液,合上暗盒暗室曝光。Image J軟件對目的蛋白條帶進(jìn)行分析并測定灰度值,以β-actin條帶灰度值進(jìn)行校正。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Myric不同濃度、不同干預(yù)時間對TG含量的影響

    不同濃度Myric干預(yù)48和72 h后的TG含量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.823和125.113,均P=0.000)。隨著Myric干預(yù)濃度的提高,細(xì)胞內(nèi)TG含量逐漸降低,干預(yù)濃度達(dá)到100 μmol/L時,細(xì)胞內(nèi)TG含量為最小值。100 μmol/L時48和72 h比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

    表1 不同劑量的Myric及不同干預(yù)時間對TG含量的影響[mmol/(g·protein),±s]

    表1 不同劑量的Myric及不同干預(yù)時間對TG含量的影響[mmol/(g·protein),±s]

    注:1)與同時間其他濃度比較,P <0.05;2)與同濃度48 h比較,P <0.05

    TG 48 h 72 h 0 μmol/L 0.1 730±0.0 099 0.1 867±0.0 034 1 μmol/L 0.1 712±0.0 110 0.1 857±0.0 046 5 μmol/L 0.1 607±0.0 033 0.1 623±0.0 058 10 μmol/L 0.1 580±0.0 041 0.1 555±0.0 033 50 μmol/L 0.1 470±0.0 060 0.1 406±0.0 017 100 μmol/L 0.1 393±0.0 0301) 0.1 259±0.0 0371)2)F值 10.823 125.113 P值 0.000 0.000組別

    2.2 Myric不同劑量、不同干預(yù)時間對甘油含量的影響

    不同濃度Myric干預(yù)48和72 h后的甘油含量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=107.296和99.920,均P=0.000)。Myric干預(yù)后,細(xì)胞中甘油含量隨著干預(yù)濃度的提高而逐漸升高,尤其當(dāng)干預(yù)濃度為100 μmol/L時,甘油含量最高。100 μmol/L Myric干預(yù)48與72 h比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    2.3 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對TG和甘油含量的影響

    4組TG和甘油含量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=384.875和102.557,均P=0.000)。其中Myric+sh-RNA組細(xì)胞內(nèi)TG含量最低,甘油含量最高(P<0.05);與空白組比較,sh-RNA組和Myric組細(xì)胞內(nèi)TG含量下降,甘油含量上升(P<0.05)。見表3。

    2.4 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對脂滴形態(tài)及分布的影響

    顯微鏡下觀察:空白組脂滴密度極大,油紅O染色顏色深,大脂滴數(shù)量多;sh-RNA和Myric組脂滴呈戒環(huán)樣結(jié)構(gòu)圍繞細(xì)胞核,與空白組比較,脂滴密度相對減小,染色顏色變淺,大脂滴數(shù)量減少;聯(lián)合干預(yù)組鏡下脂滴數(shù)量進(jìn)一步減少,顏色進(jìn)一步變淺,無大脂滴存在。見圖1。

    表2 不同劑量Myric及不同干預(yù)時間對甘油含量的影響[mmol/(g·protein),±s]

    表2 不同劑量Myric及不同干預(yù)時間對甘油含量的影響[mmol/(g·protein),±s]

    注:1)與同時間其他濃度比較,P <0.05;2)與同濃度48 h比較,P <0.05

    甘油48 h 72 h 0 μmol/L 0.0 374±0.0 041 0.0 414±0.0 084 1 μmol/L 0.0 376±0.0 069 0.0 438±0.0 058 5 μmol/L 0.0 419±0.0 061 0.0 498±0.0 069 10 μmol/L 0.0 548±0.0 067 0.0 837±0.0 0762)50 μmol/L 0.0 947±0.0 075 0.1 220±0.0 1112)100 μmol/L 0.1 326±0.0 0721) 0.1 737±0.0 1321)2)F值 107.296 99.920 P值 0.000 0.000組別

    表3 Myric與sh-RNA聯(lián)合干預(yù)對TG和甘油含量的影響[mmol/(g·protein),±s]

    表3 Myric與sh-RNA聯(lián)合干預(yù)對TG和甘油含量的影響[mmol/(g·protein),±s]

    注:1)與空白組比較,P <0.05;2)與sh-RNA組比較,P <0.05;3)與 Myric組比較,P <0.05

    組別 TG 甘油Myric+sh-RNA 0.0 873±0.0 0481)2) 0.2 194±0.0 1121)2)sh-RNA 0.1 471±0.0 0461)3) 0.1 190±0.0 0591)Myric 0.1 305±0.0 0361) 0.1 724±0.0 1011)空白組 0.1 885±0.0 016 0.0 431±0.0 051 F值 384.875 102.557 P值 0.000 0.000

    2.5 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對PLIN1A蛋白表達(dá)的影響

    各組PLIN1A蛋白表達(dá)含量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.010,P=0.000)。Myric+sh-RNA 組PLIN1A蛋白表達(dá)含量較其他3組降低(P<0.05);與空白組比較,sh-RNA組與Myric組PLIN1A蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)。見圖2。

    圖1 脂滴油紅O染色結(jié)果 (×400)

    圖2 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對PLIN1A蛋白表達(dá)的影響

    2.6 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對脂解酶HSL和ATGL蛋白表達(dá)的影響

    各組HSL和ATGL蛋白表達(dá)含量比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=78.222和80.831,均P=0.000)。與其他3組比較,聯(lián)合干預(yù)組HSL和ATGL蛋白表達(dá)量上升(P<0.05);與空白組比較,sh-RNA組與Myric組HSL和ATGL蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖3、4。

    圖3 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對HSL蛋白表達(dá)的影響

    圖4 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對ATGL蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    3T3-L1前脂肪細(xì)胞是從小鼠分離出的具有特定分化潛能的細(xì)胞系,其本身不具有脂肪細(xì)胞的特性,但能被誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞,常被作為理想的脂代謝、細(xì)胞分化模型[12-13]。脂滴是TG在脂肪細(xì)胞中主要的儲存形式。TG的分解代謝主要在ATGL和HSL的作用下進(jìn)行[14-15]。

    在脂肪細(xì)胞中,PLIN1蛋白錨定于脂滴表面產(chǎn)生支持屏障作用,將TG與脂肪水解酶隔斷,保護(hù)其不被分解。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)下調(diào)PLIN1時,其屏障作用減弱,脂肪水解酶活性增強(qiáng),脂解速率加快,脂滴變小,細(xì)胞內(nèi)TG含量降低[16]。

    Myric干預(yù)條件的篩選實驗結(jié)果顯示,隨著Myric干預(yù)濃度的升高以及干預(yù)時間的延長,細(xì)胞內(nèi)TG含量逐漸降低,甘油含量逐漸升高。通過細(xì)胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)Myric干預(yù)濃度大于100 μmol/L,干預(yù)時間72 h時,細(xì)胞存活率低于80%;當(dāng)干預(yù)濃度為100 μmol/L,干預(yù)時間超過72 h時,細(xì)胞存活率同樣低于80%,均存在一定細(xì)胞毒性。因此,結(jié)合文獻(xiàn)查閱結(jié)果,最終確定Myric最佳干預(yù)濃度和干預(yù)時間分別為100 μmol/L和72 h,這與QIAN WANG等[9]的研究結(jié)果相一致。

    本研究結(jié)果顯示,Myric+sh-RNA聯(lián)合干預(yù)組較其他3組細(xì)胞內(nèi)TG含量降低,甘油含量則升高,幾乎觀察不到大脂滴的存在,脂滴數(shù)量也減少。而聯(lián)合干預(yù)組較單獨(dú)干預(yù)組PLIN1A蛋白表達(dá)量更低,HSL和ATGL蛋白表達(dá)量更高。因此本實驗認(rèn)為,Myric與下調(diào)PLIN1基因聯(lián)合作用比它們各自單獨(dú)干預(yù)更能有效地促進(jìn)脂肪分解,楊梅素和sh-PLIN1干擾載體引起的脂解加快可能是通過降低PLIN1A蛋白表達(dá),上調(diào)脂肪酶HSL、ATGL的表達(dá)實現(xiàn)的。

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