阿魏酸抑制角膜新生血管的作用及機制研究

孫曉偉

角膜堿燒傷引發(fā)的炎癥是導(dǎo)致角膜新生血管化的重要原因, 角膜組織內(nèi)的壞死物質(zhì)能夠趨化巨噬細胞等免疫細胞浸潤, 浸潤的炎癥細胞釋放多種細胞因子, 進一步加重組織的溶解壞死, 發(fā)生潰瘍甚至穿孔, 并能引起角膜新生血管發(fā)育［1,2］。新生血管化的角膜混濁不但會嚴重影響視力, 而且會破壞角膜免疫赦免的屬性。目前對于角膜堿燒傷治療最簡便有效的手段還是應(yīng)用激素類抗炎藥物, 然而激素的應(yīng)用具有加速角膜溶解穿孔、誘發(fā)青光眼的風(fēng)險, 因此尋找毒副作用低、療效好、應(yīng)用方便的藥物是目前該領(lǐng)域研究的有益方向。

1 資料與方法

1.1 動物和實驗試劑 C57BL/6小鼠, 6～8周, 平均體重為(20±2)g, 來源于濟南朋悅實驗動物中心。阿魏酸標準品(美國Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液；兔抗小鼠CD68單克隆一抗(美國Abcam公司)；山羊抗小鼠CD31單克隆一抗(美國Abcam公司)；驢抗兔488熒光二抗；驢抗山羊555熒光二抗；鹽酸丙美卡因滴眼液(蘇州工業(yè)園區(qū)天龍制藥有限公司)；妥布霉素眼膏(西班牙ALCON CUSI, S.A)；三溴乙醇(日本TCI)；阿佛丁溶劑叔戊醇(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 6～8周健康小鼠24只, 隨機分為PBS對照組和FA治療組, 每組12只。所有小鼠飼養(yǎng)和使用均遵從美國眼科與視覺科學(xué)協(xié)會的眼科實驗研究動物管理條例［3］。

1.2.2 小鼠角膜堿燒傷模型制作 小鼠腹腔注射1.2%阿佛丁麻醉, 用量為200 μl/10 g, 鹽酸丙美卡因滴眼液點眼行表面麻醉。將直徑2 mm的濾紙片置于裝有0.5 mol/L 氫氧化鈉的小培養(yǎng)皿中充分浸泡, 用鑷子夾取濾紙覆蓋在角膜上30 s, 棄去濾紙, 用30～50 ml生理鹽水沖洗角膜和結(jié)膜囊, 用手術(shù)刀輕輕刮去角膜上皮, 涂妥布霉素眼膏, 復(fù)蘇后常規(guī)飼養(yǎng), 建模當天為Day0(D0), 將FA粉末用PBS溶液溶解, 配制成5 mg/ml的阿魏酸滴眼液, 滴FA滴眼液或者PBS溶液, 2次/d, 5 μl/次,D7時取材。

1.2.3 角膜組織免疫熒光染色 取小鼠眼球多聚甲醛固定1 h, 將完整的角膜剪下, 保留角膜緣組織, 牛血清白蛋白封閉角膜12 h。4℃孵育山羊抗小鼠CD31(新生血管標記物)抗體和兔抗小鼠CD68(巨噬細胞標記物)抗體24 h。PBS漂洗后, 孵育驢抗兔488熒光二抗和驢抗山羊555熒光二抗2 h。Leika共聚焦顯微鏡拍片, 用CD68免疫熒光染色統(tǒng)計巨噬細胞個數(shù), ImageJ軟件計算角膜新生血管面積, 用CD31免疫熒光染色計算新生血管區(qū)域占整個角膜的百分比。

1.2.4 角膜組織聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 取同組的兩個角膜組織放入1 ml Trizol, 試劑盒提取角膜組織核糖核酸(RNA), 逆轉(zhuǎn)錄合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)。構(gòu)建Real time PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)：20 μl 反應(yīng)體系包括2 μl cDNA,10 μl 2×SYBR Premix Ex Taq, 7 μl ddH2O以及10 μmol/L引物,Real time PCR循環(huán)參數(shù)先95℃ 30 s預(yù)變性, 95℃ 5 s、60℃34 s 進行40個循環(huán)。各個樣本信使核糖核酸(mRNA)含量依照各自的D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)含量進行標準化, 利用2-△△CT法對IL-6、CCL2和MMP-9基因相對表達予以分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析, 計量資料以均數(shù)±標準差表示, 采用t檢驗,p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸明顯減少堿燒傷角膜新生血管生長及炎癥細胞浸潤的影響 應(yīng)用FA后角膜組織新生血管的生長被明顯抑制, FA治療組新生血管面積低于PBS對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。FA治療組巨噬細胞浸潤明顯減少, FA治療組巨噬細胞數(shù)量少于PBS對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見表 1。

2.2 阿魏酸下調(diào)堿燒傷角膜組織促炎因子表達 發(fā)現(xiàn)FA能夠明顯抑制角膜組織中IL-6、CCL2和MMP-9基因的表達,FA治療組的IL-6、CCL2以及MMP-9均少于PBS對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見表2。

表1 FA治療組和PBS對照組角膜新生血管面積和巨噬細胞浸潤的比較

表1 FA治療組和PBS對照組角膜新生血管面積和巨噬細胞浸潤的比較

注：與PBS對照組比較, ap＜0.05

組別 只數(shù) 新生血管面積(%) 巨噬細胞數(shù)量(105個/g)PBS對照組 6 50.12±8.56 86.75±5.10 FA治療組 6 31.12±5.88a 46.67±4.20a t 4.481 14.860 p＜0.05 ＜0.05

表2 FA治療組和PBS對照組角膜組織促炎因子表達的比較

表2 FA治療組和PBS對照組角膜組織促炎因子表達的比較

注：與對照組比較, ap＜0.05

組別 只數(shù) IL-6(pg/ml) CCL2(ng/ml) MMP-9(ng/ml)PBS 對照組 6 5.32±0.46 17.12±1.56 10.32±0.73 FA治療組 6 3.12±0.37a 12.45±1.15a 5.11±0.58a t 9.128 5.902 13.688 p＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

角膜是屈光系統(tǒng)的重要組成部分, 維持角膜的無血管狀態(tài)對于保持角膜透明性、低免疫源性具有重要的生理意義。堿燒傷角膜組織早期以局部組織強烈的炎癥為特征, 過度的炎癥細胞浸潤及細胞因子表達會使組織中促新生血管及抑制新生血管機制失衡。本研究針對炎癥促發(fā)角膜新生血管生成這一角度開展研究, 首次利用FA治療角膜堿燒傷動物模型,結(jié)果證明FA可以有效治療角膜堿燒傷誘發(fā)的新生血管。

FA是植物界普遍存在的一種酚酸, 在植物體內(nèi)很少以游離態(tài)存在, 主要以低聚糖多胺、脂類和多糖形式存在, 是當歸、川芎、阿魏等中藥的有效成分之一。最近有研究表明［3,4］, FA能夠抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng), 小膠質(zhì)細胞是存在神經(jīng)系統(tǒng)免疫細胞, 與單核/巨噬細胞功能相似,包括單核/巨噬細胞在內(nèi)的炎癥組織細胞能分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)等血管生成因子促進新生血管的形成［5］。本研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用FA后, 角膜組織中浸潤的單核/巨噬等炎癥細胞數(shù)量明顯減少, 提示局部組織內(nèi)的炎癥受到抑制。

IL-6在許多研究中被證實具有直接促進新生血管的作用, Yao等［6］研究發(fā)現(xiàn)IL-6可以通過ERK1/2信號通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞釋放VEGF、MMP-9等物質(zhì)促進新生血管。還有研究［7］證實IL-6誘導(dǎo)的新生血管有缺陷, 缺乏周細胞覆蓋導(dǎo)致滲透性明顯增加。CCL2除了可以趨化炎癥細胞促進新生血管之外, 也可通過促進組織MMP-2、MMP-9的表達發(fā)揮作用［8］。基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是一組降解細胞外基質(zhì)的依賴鈣(Ca)和鋅(Zn)離子蛋白水解酶, 具有修復(fù)損傷、血管再生、促進腫瘤轉(zhuǎn)移等作用。其中MMP-9為機體中主要的Ⅳ型膠原酶, 在許多腫瘤組織中表達升高并促進新生血管生成［9］, 角膜組織內(nèi)植入活化的巨噬細胞, 細胞分泌的MMP-9及VEGF會誘導(dǎo)角膜新生血管的生成［10］。

綜上所述, 本研究表明FA可以通過抑制炎癥細胞特別是巨噬細胞的浸潤, 抑制角膜組織中促炎、促血管的細胞因子表達, 發(fā)揮抑制新生血管的作用, 為堿燒傷角膜新生血管的治療策略提供了有益參考。