SAPK/JNK信號通路在腦梗死后神經(jīng)元凋亡中的作用*

李 欣， 魏紅艷， 胡春林， 荊小莉， 熊 艷， 詹 紅， 廖曉星

(中山大學附屬第一醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510080)

中風依然是目前迫切需要解決的醫(yī)療問題之一，除了急性缺血缺氧導致的腦細胞壞死外，慢性期的細胞凋亡也是導致腦功能受損的重要原因。缺血再灌注損傷、過度的炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性等因素都可以引發(fā)并加重這一病理生理過程。應(yīng)激活化的蛋白激酶/c－Jun氨基端激酶(stress－activated protein kinase/c－Jun amino－ terminal kinase，SAPK/JNK)信號通路是各種應(yīng)激刺激(包括紫外線、輻射、神經(jīng)酰胺、炎癥因子等)影響機體的最強力信號途徑之一［1，2］。JNK的活化介導參與了各種損傷引致的細胞凋亡過程，但JNK信號通路的調(diào)控機制尚未研究清楚，其與MAPK信號通路中其它通路的聯(lián)系、自身亞型間相互作用的具體機制、通路中參與信號轉(zhuǎn)導的支架蛋白的作用亦都需要進一步深入研究。bcl－2基因家族是目前較為公認與凋亡密切相關(guān)的基因，bcl－2是最主要的細胞凋亡抑制基因，bax是最主要的細胞凋亡促進基因，兩者表達產(chǎn)物的比值(Bcl－2/Bax)影響細胞凋亡的發(fā)生［3］。本研究擬觀察腦梗死后SAPK/JNK及Bcl－2/Bax信號途徑中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化，以探尋各種病理因素引發(fā)神經(jīng)元凋亡的分子機制，為將來的干預治療尋找良好的作用靶點。

材料和方法

1 動物與方法

1.1 動物 動物實驗遵照1996版《美國實驗動物使用指引》(NIH Publications No.80－23)的要求進行，并獲得中山大學動物倫理委員會的批準。所有實驗遵循隨機和雙盲的原則。

1.2 光化學法大腦皮層局灶缺血梗死模型(photothrombotic cortical injury，PCI) 光化學法大腦皮層局灶缺血實驗大鼠模型根據(jù)Watson等［4］的方法制作，局部細節(jié)稍有改動。選擇體重約250 g的雄性SD大鼠，腹腔內(nèi)注射氯胺酮(ketamine，80 mg/kg)和甲苯噻嗪(xylazine，8 mg/kg)進行麻醉。生理鹽水稀釋的玫瑰紅(40 mg/kg BW)通過股靜脈注入體內(nèi)。在腦立體定位儀上固定動物，切開頭皮暴露顱骨表面。把一根直徑10 mm的光導纖維棒定位連接在顱骨前囟點后3 mm和中線向右旁開3 mm的交界點。光導纖維棒的另一端連接冷白光源(Volpi Intralux 6000，150 W;Volpi AG)，用最大輸出功率照射8 min。實驗過程中，用體溫控制板(CMA 150;Carnegie Medicine)監(jiān)測并控制肛溫在37℃。大鼠清醒后送入動物中心飼養(yǎng)，自由飲食。在本研究中提到的假手術(shù)組大鼠，除不注射玫瑰紅外，其所有操作同上。腦梗死組和假手術(shù)組大鼠總數(shù)各為18只，6只用于PCI后24 h的組織染色檢查，6只用于PCI后7 d的電鏡檢查，6只用于PCI后7 d的Western blotting分析。通過使用旋轉(zhuǎn)實驗(IITC Life Science)對動物的肢體功能做測試和評價，具體做法參照文獻方法進行［5］。在入選實驗前，所有動物利用從 5－15 r/min逐漸加速的平衡桿對動物訓練4 d，只有那些能在轉(zhuǎn)速15 r/min情況下站立滿200 s的動物入選實驗。PCI后的1 d、7 d，再次對動物進行功能測試，在平衡桿轉(zhuǎn)速為15 r/min的情況下，每只動物測試5次，記錄每次能站立在平衡木的時間，如達到200 s則實驗終止，計算每只動物的平均停留時間。動物停留時間越短，則表面其運動功能越差。

1.3 腦組織 2，3，5 － 氯化三苯基四氮唑(2，3，5 －triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色 為鑒定制作局灶性腦梗死的有效性，對假手術(shù)組和腦梗死組大鼠在PCI后24 h的腦組織進行染色顯示。動物麻醉后斷頭取腦，放入－30℃冷凍10 min，自嗅球后2 mm做腦冠狀切片，放入1%TTC(Genetime)生理鹽水溶液中，37℃的恒溫箱中孵育30 min，正常腦組織染成紅色，缺血壞死的腦組織因線粒體被破壞不染色而成白色，取出腦片放至10%甲醛溶液中固定。

1.4 電鏡檢查 動物麻醉后斷頭取腦，0℃環(huán)境下迅速剝?nèi)」Ｋ涝顐?cè)完整大腦皮層，在梗死灶周邊位置切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織塊，固定于4%多聚甲醛4 h，4℃。用0.1 mol/L PBS液進行漂洗，2%鋨酸后固定2 h，乙醇丙酮梯度脫水后用812包埋劑包埋。超薄切片，常規(guī)鉛鈾染色，在日立HE－800透射電鏡下觀察。

1.5 Western blotting分析 快速斷頸處死動物、剝?nèi)」Ｋ涝钔瑐?cè)新鮮大腦皮層，在梗死灶周邊位置切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織塊，液氮凍存。收齊標本后，加入添加了10% 蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的裂解液(10mmol/L Tris pH7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA)，冰浴下勻漿，將勻漿液入Eppendorf 5415D低溫離心機中4℃、26000×g離心30 min。取上清，用Bio－Rad DC蛋白質(zhì)定量測定試劑盒(Bio－Rad)在分光光度計上進行蛋白質(zhì)定量測定。SDS PAGE采用4%積層膠，10% －12.5%分離膠，上樣量為40 μg，電壓12 V/cm，結(jié)束后取出凝膠電轉(zhuǎn)移至同等大小的硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜置于封閉液(TBST+2%BSA+5%脫脂奶粉)封閉1 h。加入單克隆抗體(p－JNK1、p－JNK2、p－c－Jun、p－ATF－2、total JNK1、total JNK2、Bcl－2 和 Bax)，4℃過夜。TBST漂洗5 min×3次;帶有辣根過氧化物酶(HRP)的相應(yīng) II抗(1∶500)，室溫處理1 h，TBST漂洗5 min×3次;增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminecence，Amersham)顯示陽性反應(yīng)的蛋白質(zhì)。每條帶的光亮度測定使用ImageJ分析。每個條帶的蛋白負荷量用多克隆山羊β－actin(1∶2000，C－11，Santa Cruz)檢測控制。

2 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 PCI造模后24 h梗死灶大小及動物的行為學改變

假手術(shù)組的血腦屏障完整;腦梗死組均見光照區(qū)淡玫瑰紅色染料滲出，提示假手術(shù)組無血腦屏障破壞，而腦梗死組明顯破壞。假手術(shù)組大鼠TTC染色后未見梗死灶。腦梗死組大鼠TTC染色后右頂葉照射區(qū)呈白色梗死灶，冠狀面梗死灶呈“碗形”，尖端指向側(cè)腦室，深達皮質(zhì)全層。梗死灶部位恒定，梗死灶大小基本一致，見圖1。實驗前，訓練后的大鼠在平衡木上停留的時間都達到200 s。在PCI后1 d，PCI組動物在平衡木上的停留時間顯著下降［(14.67±2.08)s vs(200±0)s，P ＜0.01］;7 d后該時間是(25.33±11.02)s，較實驗前仍有顯著下降(P＜0.01)。

Figure 1.The morphology and characteristics of the rat brain after stroke induced by photothrombotic cortical injury(PCI).A:control;B:stroke.The arrow indicates infarction area.圖1 光化學法誘導大鼠腦梗死后腦形態(tài)學及其特征鑒定

2 透射電鏡下觀察腦梗死后神經(jīng)元的損傷

PCI后7 d，在透射電鏡下觀察梗死灶側(cè)大腦皮層的形態(tài)學變化。與假手術(shù)組比較，腦梗死組可見到明顯的神經(jīng)元細胞凋亡現(xiàn)象，存在廣泛的胞漿濃縮、核固縮畸形、染色質(zhì)邊際化、染色加深;細胞器方面，可見廣泛的線粒體腫脹、空泡樣變、嵴斷裂或消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，見圖2。

Figure 2. The neurons in the ipsilesional cortex under transmission electron microscope after stroke injury.A:normal neurons(×3900);B:apoptosis of neurons(×15500);C:normal organelles(×11500);D:swollen mitochondria，vacuolar degeneration and wide endoplasmic reticulum(×11500).圖2 電鏡觀察腦梗死后神經(jīng)元的損傷

3 腦梗死對SAPK/JNK信號通路的活化作用

在腦梗死組，SAPK/JNK信號途徑中諸多因子被顯著活化，p－JNK1、p－JNK2以及其下游的p－c－Jun、p－ATF－2的水平較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.05)，而total JNK1、total JNK2水平在各組間無顯著差異(P＞0.05)。這些結(jié)果表明腦梗死對SAPK/JNK途徑有顯著的活化作用，見圖3、表1。

Figure 3.The SAPK/JNK and Bcl－2/Bax signaling pathways after stroke injury(Western blotting).The levels of p－JNK1，p－JNK2，p－c－Jun and p－ATF－2 were increased in PCI group compared with those in sham－operated group(P＜0.05).The level of Bax was increased after stroke injury，but the Bcl－2 level was not changed.圖3 腦梗死抑制SAPK/JNK和Bcl－2/Bax信號通路

表1 SAPK/JNK通路關(guān)鍵蛋白和Bcl－2、Bax相對吸光度值比較Table 1.The density of the Bcl－2，Bax and key proteins of SAPK/JNK signal pathway(.n=6)

表1 SAPK/JNK通路關(guān)鍵蛋白和Bcl－2、Bax相對吸光度值比較Table 1.The density of the Bcl－2，Bax and key proteins of SAPK/JNK signal pathway(.n=6)

▲P＜0.05 vs sham－operated group.

Group p－ATF－2 p－c－Jun p－JNK 1 p－JNK 2 Total－JNK 1 Total－JNK 2 Bcl 2 Bax Sham －operated 1.00 ±0.15 1.00 ±0.04 1.00 ±0.23 1.00 ±0.33 1.00 ±0.08 1.00 ±0.07 1.00 ±0.42 1.00 ±0.04 PCI 2.00 ±0.31▲ 1.17 ±0.08▲ 1.77 ±0.15▲ 2.29 ±0.25▲ 0.99 ±0.05 0.92 ±0.04 1.39 ±0.26 1.31 ±0.10▲

4 腦梗死對凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2和Bax的影響

與假手術(shù)組比較，腦梗死組Bcl－2水平變化不顯著，Bax水平明顯升高(P＜0.05)，見圖3、表1。

討 論

光化學法制作腦梗死模型由 Watson等［4］于1985年首次報道后，近年來被廣泛應(yīng)用于腦梗死的研究，具有可預知梗死的部位和范圍、死亡率低、重復性好等優(yōu)點。本實驗中，使用PCI法成功制成大腦皮層局灶缺血梗死模型，并伴有血腦屏障的破壞。每個梗死灶的大小基本一致，這為隨后對藥物治療效果的比較提供了前提。在假手術(shù)組未見梗死灶，說明單純光照不會引起腦組織梗死，且不會導致燒傷等并發(fā)癥。

遲發(fā)性神經(jīng)元死亡與腦缺血、腦退行性病變等的關(guān)系密切。急性腦缺血缺氧性損傷后繼發(fā)引起的細胞凋亡是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的主要方式，是腦梗死后亞急性期和慢性期病變進一步加重的重要原因之一［6，7］。本研究中，腦梗死組 PCI后7 d在海馬部位仍可見到較為廣泛的神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象，存在明顯的胞漿濃縮、核畸形、染色質(zhì)邊際化;在細胞器方面，可見廣泛的線粒體腫脹、空泡樣變、嵴消失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增寬。而在假手術(shù)組，未見到凋亡細胞，細胞核無水腫和畸形、核仁完整存在;細胞器方面，未見線粒體腫脹及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增寬、核糖體與高爾基體完整存在。

蛋白激酶介導的信號轉(zhuǎn)導通路是細胞對周圍環(huán)境變化的主要反應(yīng)之一。近年研究神經(jīng)元凋亡的熱點之一是探討多種絲裂素活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPK)信號通路的作用。MAPK是一絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，由ERK、JNK和p38組成，每一成員都各自形成獨立的信號通路及網(wǎng)絡(luò)，介導胞外信號引起核反應(yīng)信息傳遞的匯聚功能。JNK最初被命名為54 kD的SAPK，可被許多應(yīng)激誘導刺激(如脂多糖、TNF、IL－1、滲透壓應(yīng)激和紫外線)所活化，JNK通路的激活與細胞凋亡關(guān)系密切。JNK激活通過對轉(zhuǎn)錄因子 c－Jun/AP－1、ATF－2、Elk－1等磷酸化促進基因的表達及新蛋白質(zhì)的合成，新生蛋白質(zhì)可能作用于細胞凋亡途徑的某一環(huán)節(jié)而促進細胞凋亡［8］。在本研究中，腦梗死組p－JNK1、p－JNK2以及其下游的 p－c－Jun、p－ATF－2在腦梗死組較假手術(shù)組顯著升高，表明SAPK/JNK信號通路被缺血損傷激活而進一步導致組織和細胞的病變，其必然會導致更嚴重的炎癥損傷、細胞器的破壞和更多的細胞凋亡等。

對哺乳動物細胞凋亡的基因調(diào)控過程目前還不十分清楚，研究表明與細胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因幾乎都參于對細胞凋亡的調(diào)控，其中研究較多的有 bcl－ 2、c－ myc、p53、Ice、Fas/APO －1 等。bcl－2家族即細胞凋亡抑制基因，包括bcl－2、bax、bad、bcl－x等。bax基因是bcl－2基因家族的一員，其產(chǎn)物是一種與Bcl－2同源的相關(guān)蛋白，主要作用是加速細胞凋亡，并與Bcl－2一起調(diào)節(jié)細胞凋亡。Bcl－2家族的成員通常以二聚體的形式發(fā)揮作用，Bcl－2/Bcl－2、Bcl－2/Bax和 Bcl－2/Bcl－XL 抑制細胞凋亡;Bax/Bax、Bax/Bad和 Bcl－2/Bax－XL促進細胞凋亡。Bax過表達能對抗Bcl－2抑制細胞凋亡的活性，在促凋亡因素刺激下，Bcl－2/Bax比值將決定細胞的存活［3，9，10］。在本研究中，腦梗死組 Bcl－2水平變化不大，而Bax水平顯著升高，提示Bcl－2/Bax的比值降低，加速細胞的凋亡。

總之，腦梗死發(fā)生后在較長的一段時間內(nèi)都存在著以神經(jīng)元凋亡為表現(xiàn)形式的遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡，而這一過程可能與缺血缺氧性損傷激活了SAPK/JNK信號通路及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白(如Bcl－2/Bax)等機制有關(guān)。對這一病理機制的揭示，可以為治療腦損傷提供理論依據(jù)和干預靶點。

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