響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基

翟宏偉　陳曉明

摘 要：設(shè)計(jì)并通過響應(yīng)面優(yōu)化了一種適用于杏鮑菇（Pleurotus eryngii）液體發(fā)酵的新培養(yǎng)基TSM-1。以單因子試驗(yàn)篩選出指標(biāo)具有顯著影響的TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑，液體多肽蛋白肥和NaCl，并通過Box-Behnken設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析得到了3因子最優(yōu)添加量，形成TSM-1培養(yǎng)基的最優(yōu)配方：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H4O 0.5 g，NaCl 0.15 g，復(fù)合維生素B片1片（市售OTC成藥），添加TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑0.3 g，鈣蛋白2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 6.4，121 °C滅菌30 min。優(yōu)化后TSM-1培養(yǎng)基中杏鮑菇菌絲生物量可達(dá)18.70 ±0.03 g·L-1。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇；培養(yǎng)基；優(yōu)化；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：S646 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.09.014

Optimization of Pleurotus eryngii Liguid Fermentation Medium by Response Surface Methodology

ZHAI Hongwei， CHEN Xiaoming

（Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457，China）

Abstract： A new Pleurotus eryngii liquid culture medium named TSM-1 was designed and optimized by response surface methodology. Three factors were selected by single factors experiment including TSD-1 microbial growth promoter， liquid protein fertilizer and NaCl. The optimum additive amounts of three factors were determined respectively by Box-Benhnken design and response surface analysis. The optimum formula of TSM-1 culture medium was as follows： glucose 40 g， yeast extractor 10 g， KH2PO4 1 g， MgSO4·7H4O 0.5 g， NaCl 0.15 g， multivitamin tablet1piece， addingTSD-1 0.3 g， liquid protein fertilizer 2 g， distilled water 1 000 mL， pH=6.4， sterilization at 121 ℃ after 30 min. Under the optimized TSM-1 medium， the biomass of Pleurotus eryngii was reached to 18.70±0.03 g·L-1.

Key words： Pleurotus eryngii； culture medium； optimization； response surface methodology

自1948年以來(lái)，利用液體層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)各種食用菌引起人們的極大重視[1]。相對(duì)于食用菌的固體培養(yǎng)而言，液體培養(yǎng)既可以縮短培養(yǎng)周期又提高了培養(yǎng)效率，特別適合于食用菌的規(guī)模化、周年化、工廠化生產(chǎn)，要實(shí)現(xiàn)杏鮑菇的大規(guī)模商品化生產(chǎn)，應(yīng)用液體菌種是必然。截至目前，有關(guān)杏鮑菇液體培養(yǎng)均集中于杏鮑菇對(duì)不同碳氮源的利用上，但有關(guān)生長(zhǎng)促進(jìn)劑在食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

因此，筆者嘗試設(shè)計(jì)并優(yōu)化了一種新的適用于杏鮑菇的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基TSM-1，并添加了食用菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑TSD-1、鈣蛋白制劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑NaCl，以響應(yīng)面法對(duì)TSM-1液體培養(yǎng)基中這3種特殊成分進(jìn)行優(yōu)化，以培養(yǎng)基中杏鮑菇菌絲的最大生物量為標(biāo)準(zhǔn)，確定了TSM-1液體培養(yǎng)基的最優(yōu)配方，為食用菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑在杏鮑菇液體深層發(fā)酵上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

菌種杏鮑菇（Pleurotus eryngii）由天津市林業(yè)果樹研究所保藏，編號(hào)：杏5。

種子及對(duì)照培養(yǎng)基為CM培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母浸膏1 g，KH2PO4 0.46 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.4，121 ℃滅菌30 min[2]。

測(cè)試培養(yǎng)基為自行設(shè)計(jì)的TSM-1液體培養(yǎng)基，具體配方為：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H4O 0.5 g，NaCl，復(fù)合維生素B片1片（市售OTC成藥），TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑，鈣蛋白，蒸餾水1000 mL，pH值6.4，121 ℃滅菌30 min。

其中，TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑由天津市天壽食用菌有限公司購(gòu)得，主要成分為：己酸二乙氨基乙醇酯，精氨酸，?；撬?。鈣蛋白制劑，即液體多肽蛋白肥，由天津市紐艾格農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，主要成分為：氨基酸100 g·L-1，多肽50 g·L-1，Ca 30 g·L-1，Mg 10 g·L-1，Zn以及B 4 g·L-1。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過確定因子數(shù)量的Plackett-Burman設(shè)計(jì)以及確定因子水平最佳組合區(qū)域的最陡爬坡預(yù)備試驗(yàn)[3]，篩選出TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑的濃度范圍為0.03%～0.04%，鈣蛋白濃度范圍為0.2%左右，NaCl濃度在0.1%～0.2%之間。采用Box-Benhnken（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]，以TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加量為因子A，鈣蛋白制劑添加量為因子B，NaCl添加量為因子C，以發(fā)酵液中菌絲球最大生物量（干質(zhì)量）為響應(yīng)變量，進(jìn)行因子水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共生成17次獨(dú)立試驗(yàn)，析因部分試驗(yàn)次數(shù)為12次，中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)為5次，響應(yīng)曲面因子及水平見表1，試驗(yàn)計(jì)劃見表2。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 各處理培養(yǎng)基配置并定容，以5% NaOH以及5% HCl調(diào)節(jié)pH值至杏鮑菇菌絲體最適pH值6.4[5-6]，裝入250 mL廣口三角瓶，每瓶85 mL，8層紗布封口并加蓋雙層牛皮紙，121 °C滅菌30 min，冷卻后接種，CM液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組，制備方法與測(cè)試培養(yǎng)基相同。

1.2.3 菌絲培養(yǎng)及生物量測(cè)定 取4 °C冰箱中保藏的杏鮑菇試管母種，置于25 °C恒溫培養(yǎng)箱中活化48 h后，接種于CM液體培養(yǎng)基中，每瓶接種3小塊。接種后搖瓶揭去牛皮紙并置于恒溫?fù)u床中，160 r·min-1，25 °C避光培養(yǎng)5 d，待液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)細(xì)碎菌絲球時(shí)，經(jīng)酚紅肉湯無(wú)菌檢查[7]后，用無(wú)菌移液管吸取5 mL種子液（接種量約5%），接種于測(cè)試培養(yǎng)基各處理以及對(duì)照培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中，160 r·min-1，25 °C避光培養(yǎng)96 h，以菌絲體干重法[8-9]測(cè)定生物量并求取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過軟件Design-Expert.V8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過96 h的發(fā)酵后，各培養(yǎng)基處理配方及其重復(fù)中杏鮑菇菌絲的生物量見表2。由表2可以看出，處理3、5、10、13和17，即TSD-1濃度0.03%，鈣蛋白濃度0.20%，NaCl濃度0.15%時(shí)，杏鮑菇菌絲體生物量最高，其均值在18.37～18.79 g·L-1之間，較CK提高了164.32%～170.36%。

2.2 模型建立及顯著性分析

利用Design-Expert.V8.0.6對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合[4]，則杏鮑菇菌絲在TSM-1培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h后的生物量干質(zhì)量（Y）對(duì)TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加量（X1），鈣蛋白添加量（X2），NaCl添加量（X3）的實(shí)際值全變量二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=-23.318+439.959X1+164.530X2+32.923X3- 552.475X1X2+6.808X2X3-4 492.934X2 1 -391.326X2 2-116.016X2 3

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析結(jié)果見表3，回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表3可知，回歸模型統(tǒng)計(jì)學(xué)效應(yīng)極顯著且擬合度良好，該模型方程可以解釋97.8%的響應(yīng)值（杏鮑菇菌絲體生物量）的變化，說明可以用該模型預(yù)測(cè)不同TSM-1液體培養(yǎng)基中添加物的含量與杏鮑菇菌絲生物量得率的最優(yōu)解；但該模型的修正R2與預(yù)測(cè)R2之間尚有一定差距，表明不能使用該模型預(yù)測(cè)真實(shí)結(jié)果，尚需驗(yàn)證試驗(yàn)[10-11]。

從表4中可以看出，模型一次項(xiàng)表明除NaCl外，因子對(duì)杏鮑菇菌絲生物量的影響都達(dá)到了極顯著（P<0.01）水平，3個(gè)因素影響的顯著程度排列順序?yàn)椋衡}蛋白添加量>TSD-1添加量>NaCl添加量；所有二次項(xiàng)對(duì)菌絲生物量影響亦達(dá)極顯著水平（P<0.01）；根據(jù)各項(xiàng)F值大小，可知TSM-1液體培養(yǎng)基添加物在各因子的交互作用中，TSD-1×鈣蛋白（X1×X2）>鈣蛋白×NaCl（X2×X3）>TSD-1×NaCl（X1×X3），其中TSD-1（X1）與鈣蛋白（X2）交互作用達(dá)顯著水平（P<0.05），說明其響應(yīng)值對(duì)菌絲生物量有顯著影響（P<0.05），而其余交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響均不顯著（P>0.05）。

根據(jù)回歸分析結(jié)果，對(duì)TSD-1×鈣蛋白，鈣蛋白×NaCl，TSD-1×NaCl各因素之間的交互作用對(duì)杏鮑菇菌絲生物量的具體影響進(jìn)行作圖（圖1）。從圖1可以看出，TSM-1液體培養(yǎng)基中，杏鮑菇菌絲生物量隨著TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加量和鈣蛋白先增加后降低，顯示出明顯的碳氮比效應(yīng)，且鈣蛋白的影響較TSD-1明顯。TSD-1與鈣蛋白中都含有豐富的氮源，因此二者的交互作用主要體現(xiàn)在因子的不同組合引起的速效遲效氮的變化方面。

結(jié)合圖1和表4，在TSM-1液體培養(yǎng)基中，交互作用鈣蛋白×NaCl，TSD-1×NaCl幾乎是不存在的，作為滲透壓調(diào)節(jié)劑的NaCl，在高的葡萄糖含量（40 g·L-1）的TSM-1培養(yǎng)基中，其效應(yīng)很可能被葡萄糖掩蓋而無(wú)法顯現(xiàn)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)回歸模型，通過軟件分析得到上述3因子的最優(yōu)添加量為：TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑0.03%，鈣蛋白0.2%，NaCl 0.15%，在此條件下，三次平行驗(yàn)證，TSM-1培養(yǎng)基中杏鮑菇平均菌絲生物量為18.70±0.03 g·L-1，與預(yù)測(cè)值吻合良好，為對(duì)照組CM培養(yǎng)基的2.7倍。

3 結(jié) 論

（1）TSM-1液體培養(yǎng)基具體配方優(yōu)化為：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.15 g，復(fù)合維生素B片1片（市售OTC成藥），添加TSD-1微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑0.3 g，鈣蛋白2 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.4，121 ℃滅菌30 min。

（2）杏鮑菇菌絲在優(yōu)化的TSM-1培養(yǎng)基中，160 r·min-1，25 °C下培養(yǎng)96 h后，其生物量為18.70±0.03 g·L-1，相當(dāng)于傳統(tǒng)CM培養(yǎng)基的2.7倍。

（3）NaCl在高滲的TSM-1液體培養(yǎng)基中對(duì)杏鮑菇菌絲影響不大。

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