卟啉接枝細(xì)菌纖維素的制備及其光敏抗菌性能

董建成， 葛孝棟， 王清清， 魏取福

(生態(tài)紡織教育部重點實驗室(江南大學(xué))， 江蘇 無錫 214122)

光動力抗菌化學(xué)療法(PACT)[1]是基于光動力療法(PDT)，通過光敏劑與細(xì)菌結(jié)合，在光照下產(chǎn)生活性氧簇(ROS)來滅活細(xì)菌。相比于傳統(tǒng)抗菌材料，如茶多酚[2]、殼聚糖[3]、重金屬銀[4]等，PACT法生物毒性低，在滅菌過程中不會使微生物產(chǎn)生耐藥性[5]，因而在抗菌材料領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

PACT常用的光敏劑有吩噻嗪類、酞菁類、卟啉類光敏劑等。原卟啉(PpIX)是一種卟啉類光敏劑，其前驅(qū)體5-氨基酮戊酸(5-ALA)是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)藥物。游離的PpIX具有高效光敏化能力，但其回收困難，重復(fù)利用性差[6-7]。此外，PpIX價格高昂，合成工藝復(fù)雜，從而對PpIX進行固定化使其具有可重復(fù)利用性變得尤為重要。目前，光敏劑PpIX在多壁碳納米管[8-9]、多孔硅膠[10]、金屬及其氧化物納米顆粒[11-12]、殼聚糖[13-14]等方面的負(fù)載已被廣泛研究，但已有文獻對PpIX在纖維素基材類的負(fù)載，并用于光動力抗菌方面的研究不多。相比于其他材料，纖維素類基材如細(xì)菌纖維素、棉等具有天然可降解性、生物相容性和可再生性。

本文利用細(xì)菌纖維素(BC)作為PpIX固定載體，首先利用不同濃度的NaIO4氧化細(xì)菌纖維素，然后采用還原胺化反應(yīng)引入乙二胺來鍵接PpIX，最后評價了負(fù)載PpIX后的細(xì)菌纖維素對金黃色葡萄球菌的光敏抗菌效果及可重復(fù)利用性。

1 實驗部分

1.1 實驗原料與儀器

細(xì)菌纖維素(由木醋桿菌發(fā)酵制得)，氫氧化鈉、高碘酸鈉、乙二胺、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)、甲醇、乙酸、鹽酸羥胺、百里香酚藍(lán)，分析純，國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、N，N′-羰基二咪唑(CDI)、原卟啉，分析純，上海維塔試劑有限公司；金黃色葡萄球菌(ATCC-6538)，上海協(xié)久生物科技有限公司。

LABCONCO型凍干機(美國LABCONCO有限公司)； Nicolet iS 10 型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR，中國賽默飛世爾科技有限公司)；Renishaw RM1000型拉曼光譜儀(英國雷尼紹公司)；Rigaku-D/Max-2500 型X射線衍射儀(XRD，日本理學(xué)公司)；TA Q200型熱失重儀(TG,美國TA公司)；SUL 510型掃描電子顯微鏡(SEM，日本日立株式會社)；XQ500 W型氙燈(上海藍(lán)晟電子有限公司)；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；GR60DA型高壓滅菌鍋(南京康辰科學(xué)儀器有限公司)； BSP-150型生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司)。

1.2 細(xì)菌纖維素的預(yù)處理

將發(fā)酵培養(yǎng)15 d的細(xì)菌纖維素(BC)取出，浸沒在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液中，于80 ℃的水浴鍋中堿煮12 h后取出，然后更換NaOH溶液繼續(xù)堿煮12 h。最后用去離子水反復(fù)沖洗、浸泡堿煮后的細(xì)菌纖維素，用pH試紙測試其表面酸堿性，直至pH試紙不變藍(lán)。

1.3 氧化細(xì)菌纖維素的制備

首先將燒杯中的高碘酸鈉(NaIO4)溶液在恒溫?fù)u床中加熱至37 ℃，然后把直徑、厚度相近的細(xì)菌纖維素分3組分別放入NaIO4溶液中，對應(yīng)的NaIO4溶液濃度分別為0.2、0.3、0.4 mol/L。NaIO4溶液與細(xì)菌纖維素的用量為V(NaIO4)∶m(BC)=20∶1。將上述反應(yīng)體系放入到恒溫?fù)u床中，于37 ℃反應(yīng)4 h，然后加入乙二醇(體積為體系體積的1/5)中繼續(xù)反應(yīng)4 h。取出反應(yīng)后的氧化細(xì)菌纖維素(BC-CHO)，用去離子水反復(fù)沖洗、浸泡，直至用淀粉-KI試紙在BC-CHO表面測試不變黑。最后將BC-CHO放入-40 ℃冰箱預(yù)冷凍12 h后，用凍干機在5 Pa條件下干燥12 h得到BC-CHO冷凍干燥膜。

1.4 乙二胺化細(xì)菌纖維素的制備

稱取3.00 g乙二胺放入燒杯中，加入100 mL DMSO溶解，然后在燒杯中加入乙酸調(diào)節(jié)體系pH值至6.0，將燒杯放入恒溫?fù)u床中，使體系溫度上升至37 ℃，然后在體系中加入300 mg所制備的BC-CHO納米纖維膜，用鋁箔包覆燒杯避光，調(diào)節(jié)搖床速度為100 r/min，反應(yīng)12 h。取出細(xì)菌纖維素膜，用20 mL DMSO清洗3次。

稱取3.77 g氰基硼氫化鈉放入燒杯中，加入100 mL DMSO溶解，將上述洗滌后的細(xì)菌纖維素膜放入燒杯中，然后放入37 ℃恒溫?fù)u床(搖床速度為100 r/min)中反應(yīng)24 h，得到乙二胺化細(xì)菌纖維素(BC-EDA)，將BC-EDA取出后先用20 mL DMSO清洗3 次，再用30 mL去離子水清洗3 次。將洗滌后的BC-EDA放入-40 ℃冰箱預(yù)冷凍12 h，用凍干機在5 Pa條件下干燥12 h得到BC-EDA冷凍干燥膜。

1.5 原卟啉接枝氨基化細(xì)菌纖維素的制備

稱取282 mg原卟啉(PpIX)和81 mg N,N′-羰基二咪唑，溶解在75 mL 的DMSO中，然后在40 ℃搖床中活化4 h，搖床速度為120 r/min。在上述體系中加入BC-EDA凍干膜，繼續(xù)反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后先用DMSO清洗(20 mL，3次)，再用去離子水清洗(30 mL，3次)。然后于40 ℃真空干燥5 h，得到原卟啉接枝氨基化細(xì)菌纖維素膜(BC-EDA-PpIX)。BC-EDA-PpIX接枝的化學(xué)反應(yīng)流程如圖1所示。

圖1 細(xì)菌纖維素-原卟啉(BC-EDA-PpIX)接枝化學(xué)反應(yīng)流程Fig.1 Chemical reaction process of grafting PpIX on bacterial cellulose via ethylenediamine

1.6 測試與表征

1.6.1醛基含量測定

在250 mL錐形瓶中加入50 mL質(zhì)量濃度為20 g/L的鹽酸羥胺/甲醇溶液和8滴百里香酚藍(lán)指示劑，用氫氧化鈉/甲醇標(biāo)準(zhǔn)液滴定至溶液為黃色，不計消耗氫氧化鈉溶液的體積[15]。然后向錐形瓶中加入剪碎的BC-CHO樣品，40 ℃條件下充分反應(yīng)3 h后，用0.03 mol/L的氫氧化鈉/甲醇溶液滴定至黃色，且在30 s內(nèi)保持不褪色。醛基含量計算公式為

C=0.03V/m

式中：C為BC-CHO中的醛基含量， mmol/g；V為滴定時消耗的氫氧化鈉/甲醇溶液的體積， mL；m為BC-CHO的質(zhì)量，g。

1.6.2表面形貌觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察纖維膜的表面形貌和結(jié)構(gòu)。樣品在掃描前需經(jīng)過噴金處理，以便降低其表面放電效應(yīng)。

1.6.3化學(xué)結(jié)構(gòu)測試

采用傅里葉變換紅外光譜儀對接枝反應(yīng)前后的BC膜樣品進行測試，利用衰減全反射紅外光譜法(ATR-FT-IR)進行分析。分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16，波數(shù)范圍為4 000～800 cm-1。

1.6.4拉曼光譜測試

采用拉曼光譜儀對PpIX(粉末)、BC-EDA膜、BC-EDA-PpIX膜進行測試，樣品在514 nm激發(fā)獲得拉曼光譜。

1.6.5熱穩(wěn)定性測試

利用熱失重分析儀對材料的熱穩(wěn)定性進行測試。測試范圍為20～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min，在N2保護下進行。

1.6.6晶體結(jié)構(gòu)測試

采用X射線衍射儀對試樣的晶體結(jié)構(gòu)進行分析。實驗條件為：Cu靶，加速電壓40 kV，電流強度200 mA，掃描速度4(°)/min，掃描范圍5°～40°。

1.6.7光動力抗菌評價

參照AATCC 100—2012《抗菌紡織品的評價方法》對BC-EDA-PpIX纖維膜光敏抗菌性能進行評價。

將干燥的空白纖維膜和BC-EDA-PpIX纖維膜分別作為空白對照樣和實驗樣。在各樣品上剪取若干形狀厚度均一的圓形試樣，平鋪于24孔板內(nèi)。取0.1 mL濃度為1×108～3×108CFU/mL的菌液接種在各試樣上。每個樣品均分為2組，分別置于光照及暗室的環(huán)境下培養(yǎng)30 min，隨后將原菌液及試樣上的菌液在離心管中依次等梯度稀釋106倍，制作出10倍稀釋系列。分別從稀釋系列的各離心管中取10 μL溶液注入含瓊脂培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。最后測其菌落數(shù)，計算出抑菌率r，對抗菌效果進行評價。

式中：N0、Ni分別為平板上原樣生長細(xì)菌的數(shù)和樣品抗菌后所剩余的菌落數(shù)。

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精洗滌上述BC-EDA-PpIX纖維膜2次，干燥后再按上述方法進行抗菌評價；然后繼續(xù)用酒精洗滌2次，干燥后進行抗菌評價，測試其抗菌持久性。

2 結(jié)果與討論

2.1 BC-CHO纖維膜的結(jié)構(gòu)與性能分析

2.1.1醛基含量分析

通過鹽酸羥胺法測定BC-CHO中醛基的含量。當(dāng)NaIO4濃度分別為0.2、0.3、0.4 mol/L時，測得對應(yīng)的二醛細(xì)菌纖維素醛基含量分別為2.13、3.42、3.76 mmol/g。NaIO4可特異性地氧化纖維素葡萄糖環(huán)上2、3號位上的羥基生成二醛細(xì)菌纖維素BC-CHO。采用高濃度的NaIO4，在氧化過程中細(xì)菌纖維素內(nèi)部氫鍵會被嚴(yán)重破壞，細(xì)菌纖維素尺寸劇烈收縮，力學(xué)性能銳減，影響其應(yīng)用[16-17]；因此，選擇NaIO4濃度為0.3 mol/L所制備的BC-CHO進行后續(xù)卟啉接枝反應(yīng)，其氧化程度適當(dāng)，纖維膜尺寸變化不大。

2.1.2BC-CHO纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖2 不同NaIO4濃度氧化的纖維膜紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of fiber membranes oxidized at different NaIO4 concentrations

2.1.3BC-CHO纖維膜的晶體結(jié)構(gòu)分析

圖3為BC及不同氧化程度BC-CHO的XRD譜圖。細(xì)菌纖維素是高結(jié)晶度的I型纖維素，其結(jié)晶度可達(dá)60%～70%，圖中衍射角2θ為14.4°、16.7°、22.6°處為I型纖維素的特征衍射峰[15]。BC經(jīng)過NaIO4選擇性氧化后，BC-CHO部分保留了初始BC的I型纖維素特征峰，同時BC-CHO逐步在2θ為12.6°、20.5°、21.7°處出現(xiàn)衍射峰，并伴隨著I型纖維素特征峰的降低，這表明初始BC在被NaIO4氧化過程中發(fā)生部分晶型轉(zhuǎn)變(II型纖維素)。由于NaIO4選擇性氧化造成了纖維素葡萄糖吡喃環(huán)的開環(huán)，使得部分鏈節(jié)被破壞，使得原有的結(jié)晶規(guī)整度降低，從而在XRD譜圖中顯示了較多位于主要衍射峰之間的雜散峰，其中18°～20°處的是非晶纖維素的衍射峰[[21]。

圖3 不同NaIO4濃度氧化的纖維膜X射線衍射譜圖Fig.3 XRD spectra of fiber membranes oxidized by NaIO4at different concentrations

2.1.4BC-CHO纖維膜的熱穩(wěn)定性分析

圖4示出BC、BC-CHO纖維膜的TG和DTG曲線。BC的化學(xué)改性會顯著改變纖維膜的熱分解行為，如熱分解溫度降低、殘?zhí)柯侍岣叩萚22]。從圖4可看出，氧化后的細(xì)菌纖維素膜熱分解行為發(fā)生了明顯的變化。在N2氛圍中，BC在280 ℃開始分解，在300～340 ℃時質(zhì)量損失速率增大，纖維素在分解時，先得到左旋葡萄糖，然后進一步分解為CO、CO2等小分子[23]。BC-CHO分3步降解：第1步，100 ℃左右時的質(zhì)量損失為葡萄糖吡喃環(huán)上醛基形成的水合醛和半縮醛受熱脫水造成的；第2步在220～250 ℃脫水；第3步在280～300 ℃降解。所有BC-CHO的熱分解溫度都低于BC，且隨氧化程度的提高逐漸降低。

圖4 不同NaIO4濃度氧化的纖維膜熱穩(wěn)定性曲線Fig.4 TG(a) and DTG (b) curves of fiber membranes oxidized by different concentrations NaIO4

2.2 BC-EDA纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖5為BC、BC-CHO、BC-EDA纖維膜的紅外光譜圖?？梢钥闯觯航又σ叶泛蟮难趸?xì)菌纖維素在1 730、880 cm-1處的醛基特征峰消失；在1 560 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，為BC-EDA上N—H的彎曲振動峰[24]。醛基特征峰的完全消失和新吸收峰的出現(xiàn)，表明BC-CHO上的醛基完全被乙二胺取代。

圖5 納米纖維膜的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of naofibrous membranes

2.3 BC-EDA-PpIX纖維膜的性能分析

2.3.1PpIX接枝前后細(xì)菌纖維素膜的形貌結(jié)構(gòu)

圖6示出初始細(xì)菌纖維素BC和原卟啉接枝后BC-EDA-PpIX的表面形貌?？梢钥闯?，BC在進行化學(xué)改性前，表面纖維集束包覆成連續(xù)相，形成對內(nèi)層纖維的遮掩。經(jīng)過氧化、PpIX接枝后，BC表面集束的連續(xù)相消失，顯露出內(nèi)層纖維，BC-EDA-PpIX內(nèi)層纖維的高比面積更有利于卟啉與底物的接觸，從而有效發(fā)揮負(fù)載卟啉的光敏化能力。

圖6 BC和BC-EDA-PpIX纖維膜的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.6 SEM images of BC and BC-EDA-PpIX fibrous membranes

2.3.2BC-EDA-PpIX的拉曼光譜

圖7為PpIX、BC-EDA、BC-EDA-PpIX的拉曼光譜圖。由于PpIX具有對稱結(jié)構(gòu)，所以采用拉曼光譜儀來表征PpIX固定化后的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖7 PpIX粉末、BC-EDA-PpIX纖維膜、BC-EDA纖維膜的拉曼光譜圖Fig.7 Raman spectra of pure PpIX powder, BC-EDA-PpIX and BC-EDA fibrous membrane

2.3.3BC-EDA-PpIX纖維膜的抗菌性能

表1 BC-EDA-PpIX纖維膜對金黃色葡萄球菌的殺菌效果Tab.1 Antibacterial effect of BC-EDA-PpIX fibrous membrane against Staphylococcus aureus

BC-EDA-PpIX經(jīng)過酒精洗滌后光敏抗菌效果雖有所降低，但經(jīng)過5次洗滌后抑菌率仍達(dá)到56.61%。細(xì)菌纖維素的直徑在納米級別，納米尺寸的結(jié)構(gòu)容易受到外界因素的影響，而PpIX共價結(jié)合在細(xì)菌纖維素膜表面，洗滌過程中可能會使部分光敏劑脫落，造成抗菌效果下降。在今后的研究工作中將會采用大直徑纖維素制品如棉織物、麻織物等作為光敏劑載體進行共價負(fù)載，制備光敏抗菌織物，以實現(xiàn)長效的光敏抗菌效果。

3 結(jié) 論

1)通過改變NaIO4濃度制備出不同醛基含量的氧化細(xì)菌纖維素膜(BC-CHO)，其醛基含量越高，BC-CHO的熱分解溫度越低，結(jié)晶性越低。適當(dāng)氧化的細(xì)菌纖維素在保持良好形貌結(jié)構(gòu)的同時具有較高的醛基含量。

2)原卟啉接枝氨基化細(xì)菌纖維素膜(BC-EDA-PpIX)具有良好的光敏抗菌效果，首次光動力抗菌，金黃色葡萄球菌的殺菌率超過98%以上，經(jīng)過5次酒精洗滌后仍具有良好的抑菌效果。

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