絲素蛋白的磷酸化及其仿生礦化膜的制備

周 倩， 袁久剛， 李 瀾， 王 平， 王 強

(生態(tài)紡織教育部重點實驗室(江南大學(xué))， 江蘇 無錫 214122)

絲素蛋白不僅可用作纖維原料，因其良好的生物相容性，在生物材料制備中也有潛在用途[1]。為拓寬絲素在生物材料及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，不少研究者采用化學(xué)或生物的方法進行絲素改性加工，如采用辣根過氧化物酶(HRP酶)催化絲素接枝丙烯酸，加速礦化中絲素表面鈣鹽沉積，制備仿生礦化材料[2]；采用磷酸進行絲素磷酸化，賦予絲素膜抗凝血性，用于制作止血材料等[3]。

羥基磷灰石在自然界中主要由鈣磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))自然礦物化形成，羥基磷灰石具有優(yōu)良的生物相容性和生物活性，可作為骨骼或牙齒的誘導(dǎo)因子被用于骨修復(fù)手術(shù)中。在生物材料表面生成羥基磷灰石的方法有很多種，按照礦化液的不同大致可分為3類：模擬體液法、交替礦化法和過飽和鈣化溶液法[4]。

本文采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑對絲素蛋白進行磷酸化，其機制是：絲素蛋白中絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)的羥基和賴氨酸(Lys)的氨基與無機磷發(fā)生酯化反應(yīng)，形成C—O—P和C—N—P的結(jié)構(gòu)[5]。在磷酸化的絲素膜材料基礎(chǔ)上進行仿生礦化，誘導(dǎo)羥基磷灰石的形成，實現(xiàn)絲素基仿生礦化材料的制備。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

桑蠶絲練白綢(35.5 g/m2，江蘇鑫緣繭絲綢有限公司)；三聚磷酸鈉(STP)、一水溴化鋰、無水氯化鈣、無水乙醇、十二水磷酸氫二鈉、對二苯酚、鉬酸銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸等試劑(分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1絲素溶液的制備

將桑蠶絲練白綢溶解在溴化鋰/無水乙醇/水(物質(zhì)的量比為1∶1∶2)體系中，在75 ℃條件下攪拌2 h得到絲素(SF)溶液，用去離子水對絲素溶液進行透析，直至透析液電導(dǎo)率值小于4 μS/cm，再將絲素溶液離心去除不溶物，以稱量法標(biāo)定上清液濃度，將絲素溶液在4 ℃條件下保存。

1.2.2絲素的磷酸化

分別取40 g/L的絲素蛋白溶液各30 mL, 用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值分別為8、9、10。在35 ℃作用下，緩慢加入0.24 g三聚磷酸鈉反應(yīng)30 min，反應(yīng)過程中用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使其保持在加入STP前的固定值。反應(yīng)結(jié)束后冷卻，調(diào)節(jié)溶液pH值至中性。為探究STP的用量對絲素磷酸化的影響，同樣條件下控制pH值為10，溫度為35 ℃，分別加入質(zhì)量分別為0.06、0.24 g的STP(不同質(zhì)量的STP與SF反應(yīng)后的溶液分別標(biāo)記為SF-1, SF-2)，反應(yīng)30 min。

1.2.3絲素膜的制備

風(fēng)干膜制備：將STP磷酸化后的絲素溶液中加入0.125 g甘油，混合均勻后將其轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯模具中，在恒溫恒濕箱中以流延法制備風(fēng)干膜。

凍干膜制備:將STP質(zhì)量分別為0.06、0.24 g的磷酸化后的絲素溶液進行透析。透析完畢后將溶液在-50 ℃冷凍干燥成膜，將凍干膜在50%乙醇醇化處理4 h后再次凍干(不同質(zhì)量的STP與SF反應(yīng)后的膜分別標(biāo)記為SF-1膜，SF-2膜)。

1.2.4絲素/羥基磷灰石復(fù)合材料的制備

絲素/羥基磷灰石復(fù)合材料采用交替礦化法制備[6]。分別取未處理絲素凍干膜和磷酸化絲素凍干膜，用CaCl2/Tris-HCl溶液(CaCl2濃度為500 mmol/L；Tris-HCl濃度為50 mmol/L，pH值為7.45)進行鈣化，先在37 ℃下處理30 min，以去離子水水洗后，再將樣品浸漬在Na2HPO4/Tris-HCl (Na2HPO4濃度為300 mmol/L；Tris-HCl濃度為50 mmol/L，pH值為8.50)溶液中，在37 ℃下處理30 min，然后用去離子水水洗。上述過程被定為1個Ca-P礦化周期，重復(fù)7個周期直至結(jié)束。作為對比，磷酸化絲素膜只用CaCl2處理，不加Na2HPO4。不同礦化的處理條件如表1所示。

表1 不同礦化處理條件Tab.1 Different mineralization conditions of silk membranes

1.3 分析測試方法

1.3.1磷含量的測定

依據(jù)GB 12393—1990《食物中磷的測定方法》，采用磷鉬藍比色法[7]測定磷含量，原理為：無機磷元素在酸性溶液中會與鉬酸銨結(jié)合生成磷鉬酸銨，經(jīng)對苯二酚、亞硫酸鈉還原磷鉬酸銨后會形成藍色化合物鉬藍,其最大吸收波長是660 nm。

磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取1～5標(biāo)準(zhǔn)液(磷標(biāo)準(zhǔn)液用磷酸氫二鉀配制，質(zhì)量濃度為1 mg/mL)至50 mL刻度試管中，然后依次加入2 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的鉬酸銨溶液、1 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的亞硫酸鈉溶液、1 mL質(zhì)量分數(shù)為0.5%的對苯二酚溶液，加水定容到20 mL，搖晃試管使溶液混合均勻，再靜置30 min。測定溶液660 nm處的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.053 6x+0.089 5，R2=0.996 23。

取反應(yīng)后溶液5 mL，加入15 mL三氯乙酸溶液(2 mol/L)沉淀絲素蛋白，靜置一段時間后離心，取上層清液2 mL及同樣的空白溶液，分別置于20 mL具塞試管中，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線，磷轉(zhuǎn)移量以磷酸化后體系中磷質(zhì)量濃度的降低率表示。

1.3.2圓二色譜和粒徑測試

通過圓二色光譜儀檢測絲素溶液二級結(jié)構(gòu)的變化，取絲素樣品加入到1 mm 比色皿中，檢測波長范圍為195～250 nm，掃描速度為100 nm/min。使用粒徑及Zeta 電位分析儀測定25 ℃條件下絲素溶液的粒徑大小和粒徑分布。

1.3.3化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

采用Nicolet iS 10傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)的全反射(ATR)模式，在掃描范圍為4 000～650 cm-1內(nèi)對不同的冷凍干燥膜樣品進行紅外光譜分析。掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm-1。

1.3.4絲素膜對陽離子的吸附效果

以陽離子染料進行絲素膜沾色實驗，沾色工藝條件：溫度為85 ℃，處理時間為30 min，浴比為1∶100，其中染料質(zhì)量濃度為0.2 g/L。吸附能力以沾色率表示，即膜材料沾色前后染液吸光度的變化率。

1.3.5斷裂強度測試

采用YG141型織物厚度儀測定絲素風(fēng)干膜厚度，采用萬能材料試驗機測定膜的力學(xué)性能，拉伸速度為40 mm/min，夾距為40 mm。測試前將樣品裁剪成尺寸為80 mm×5 mm的樣條，并在恒溫恒濕箱(溫度為20 ℃，相對濕度為65%)中平衡24 h，每個樣品進行10次重復(fù)實驗，樣品斷裂強度和斷裂伸長率分別由以下公式計算：

式中：Q為斷裂強度，MPa；P為強力，N；d為厚度，mm；b為膜寬度，mm；ε為斷裂伸長率，%；L′為伸長，mm；L為原長，mm。

1.3.6熱力學(xué)性能測試

使用Q200型差示掃描量熱儀測定不同條件處理后的絲素凍干膜。測試條件：樣品質(zhì)量為5 mg，升溫速度為10 ℃/min，升溫范圍為100～400 ℃，氮氣流量為50.0 mL/min。

1.3.7表面元素測試

將樣品置于能量色散X射線能譜儀中分別進行線掃描和面掃描，測試出絲素膜表面元素含量和分布[8]。

1.3.8形貌觀察

使用SU1510型掃描電子顯微鏡觀察所制備的絲素材料的表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，樣品經(jīng)過噴金處理，掃描加速電壓為5 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值和STP質(zhì)量對磷酸化程度影響

磷轉(zhuǎn)移量一定程度上反映絲素蛋白的磷酸化效果，采用磷鉬藍比色法測得：當(dāng)pH值分別為8、9、10時，磷轉(zhuǎn)移量分別為35.5%、42.3%、67.1%。在pH值為8時磷轉(zhuǎn)移率最低，在pH值為10時磷轉(zhuǎn)移率最高。pH值較低時，磷酸根主要與賴氨酸反應(yīng)，但絲素中賴氨酸含量很低，因此磷酸化程度就低。當(dāng)堿性增強時，Ser—OH電離成Ser—O-，此時親核取代效應(yīng)增強，游離的磷酸根基團與Ser—O-基團反應(yīng)，氨基酸殘基側(cè)鏈中的羥基活性會變得越來越高[9]，絲素蛋白磷酸化程度增加。

圖1示出不同質(zhì)量的STP對磷酸化程度的影響。當(dāng)STP質(zhì)量較低時，隨著STP質(zhì)量的增加，磷酸化程度顯著增加；當(dāng)STP質(zhì)量達0.12 g時，磷酸化程度趨于穩(wěn)定。這表明磷酸根較少時，不是所有氨基酸殘基都能夠參加反應(yīng)，有些可能因空間位阻和所處的化學(xué)環(huán)境限制了其反應(yīng)[10]。當(dāng)磷酸根足夠多時，氨基酸殘基能充分反應(yīng)，磷酸化程度最大并趨于穩(wěn)定。

圖1 不同質(zhì)量的STP對磷酸化程度的影響Fig.1 Effect of mass of STP on phosphorylation

2.2 磷酸化對絲素蛋白結(jié)構(gòu)和粒徑的影響

采用圓二色譜考察了絲素經(jīng)過磷酸化后二級結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果見圖2?？煽闯?，絲素溶液在220 nm處有負峰，這說明絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主[11]。當(dāng)用STP處理后，220 nm 處負峰強度增大，表明絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。通過計算得到絲素蛋白二級結(jié)構(gòu)的分布，見表2。

由表2可知，SF的螺旋結(jié)構(gòu)最少，無序度最高。當(dāng)用STP處理SF后，其樣品的螺旋結(jié)構(gòu)都增加了，無規(guī)卷曲都有不同程度的減少，即磷酸化使得絲素的結(jié)構(gòu)更加完整，這也為后續(xù)的絲素膜材料構(gòu)建奠定了良好的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖2 STP處理后絲素溶液的圓二色譜圖Fig.2 Circular dichroism of silk fibroin solution after STP treatment

%

由表2還可看出，當(dāng)STP質(zhì)量為0.06 g時，其螺旋結(jié)構(gòu)最多，無規(guī)卷曲最少，即適度的磷酸化對絲素蛋白結(jié)構(gòu)影響較大。

為進一步驗證磷酸化對絲素溶液粒徑產(chǎn)生的影響，測定了反應(yīng)前后絲素溶液的粒徑分布變化，結(jié)果如圖3所示。可以看出，3組樣品的主要粒徑分布范圍在100～250 nm之間，其中SF的平均粒徑和多分散性指數(shù)(PDI)分別為143.5 nm和0.528。當(dāng)用STP處理SF 溶液后，粒徑分布都有不同程度的增大。STP質(zhì)量為0.06 g時，平均粒徑和PDI分別為158.5 nm和0.566；而當(dāng)STP質(zhì)量為0.24 g時，絲素溶液的平均粒徑增大到171.5 nm，PDI為0.615。這是因為磷酸根的引入使得絲素溶液間的靜電斥力增加，使得粒徑分布增加。

圖3 STP處理后絲素溶液的粒徑分布Fig.3 Size distribution of fibroin solution after STP treatment

2.3 磷酸化絲素化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

為進一步證明絲素中氨基酸與STP發(fā)生反應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化，利用紅外光譜儀的全反射模式對不同處理條件的絲素膜進行測試，其結(jié)果如圖4所示。可以看出，絲素蛋白的特征酰胺鍵主要分布在1 654、1 513 cm-1附近，表明經(jīng)過冷凍干燥后的再生絲素蛋白材料以無定形結(jié)構(gòu)為主[12]。STP中磷酸根的特征峰在896 cm-1處，絲素經(jīng)過STP處理后，在921 cm-1處有新峰，其位置對應(yīng)是P—O鍵的伸縮振動峰[13]，即證明絲素成功被STP磷酸化。

圖4 磷酸化的絲素凍干膜ATR-FT-IR光譜圖Fig.4 ATR-FT-IR spectra of phosphorylated silk fibroin

2.4 磷酸化絲素膜對陽離子的吸附效果

磷酸化影響絲素蛋白表面電荷分布，使得絲素蛋白分子表面負電性基團增多。借助陽離子染料沾色實驗，探究磷酸化絲素表面對陽離子的吸附。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STP質(zhì)量為0、0.06、0.24 g時對應(yīng)的沾色率分別為9.3%、16.2%、31.8%。磷酸化會在蛋白質(zhì)分子中引入負電性磷酸根基團，陽離子染料帶正電，與絲素間結(jié)合力主要為庫侖引力。根據(jù)絲素膜表面沾色率變化，可判別出絲素膜磷酸化的程度。當(dāng)STP質(zhì)量為0.24 g時,絲素對染料的沾色率增至31.8%，表明絲素磷酸化有利于膜表面陽離子的吸附，為后續(xù)絲素表面鈣磷酸鹽的吸附和沉積奠定了基礎(chǔ)。

2.5 磷酸化對絲素?zé)崃W(xué)和力學(xué)性能影響

為深入分析磷酸化對絲素膜材料熱力學(xué)性能的影響，采用差示掃描量熱儀分析絲素膜的熱力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度，結(jié)果如圖5所示。可以看出，SF蛋白膜存在3個明顯的吸熱峰，其中在50、121 ℃附近的吸熱峰分別是由于自由水和結(jié)合水的蒸發(fā)引起的，在278 ℃附近的吸熱峰則是由于絲素蛋白膜材料熱降解引起的，該溫度為絲素蛋白的熱分解溫度[14]。經(jīng)過STP處理后的SF膜，絲素蛋白的熱性能發(fā)生了較小的變化，但從圖5可看出，當(dāng)溫度升高到285 ℃左右以后，經(jīng)過磷酸化的SF膜完全被降解，可見STP的引入使得SF膜的熱穩(wěn)定性有所下降。原因是：磷酸根的引入使得絲素蛋白質(zhì)分子間的氫鍵被大量破壞，引入大量負電基團使靜電斥力加大，從而導(dǎo)致樣品的熱性能急劇降低。

圖5 磷酸化絲素膜的DSC曲線Fig.5 DSC curves of phosphorylated silk fibroin membranes

為探究絲素磷酸化對風(fēng)干膜材料力學(xué)性能的影響，測定了絲素風(fēng)干膜的斷裂強度和斷裂伸長率，結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯觯寒?dāng)STP質(zhì)量為0.06 g時，對應(yīng)的樣品斷裂強度和斷裂伸長率最高；當(dāng)STP質(zhì)量為0.24 g，所對應(yīng)的樣品斷裂強度、斷裂伸長率最低。當(dāng)STP質(zhì)量為0.24 g時，樣品斷裂強度下降，這是因為在磷酸化過程中，蛋白分子中羥基或氨基磷酸化后，不僅使分子間氫鍵減少，且引入的負電磷酸根基團加大了蛋白分子間的靜電斥力。當(dāng)STP質(zhì)量為0.06 g時，樣品斷裂強度比原樣稍有提高。從絲素二級結(jié)構(gòu)可看出，絲素蛋白經(jīng)0.06 g STP處理后，無序度最低，且螺旋結(jié)構(gòu)變多，使得力學(xué)性能增加，即抵消了磷酸化對膜材料強力的消極影響。

圖6 磷酸化絲素膜的力學(xué)性能Fig.6 Mechanical properties of phosphorylated silk fibroin membranes

2.6 仿生礦化膜表面元素和形貌分析

采用能量色散X射線能譜儀分析經(jīng)過仿生礦化絲素膜表面不同元素的含量，其結(jié)果如表3所示。當(dāng)SF經(jīng)STP處理后，引入了部分磷酸根，因此將磷酸化后的絲素膜只用CaCl2處理時，其中Ca元素和P元素含量隨著磷酸化程度的提高而增加，其中P元素的引入都是STP磷酸化導(dǎo)致的，也因此間接反映磷酸化程度。當(dāng)用CaCl2/Na2HPO4對磷酸化的絲素膜進行仿生礦化后，Ca元素和P元素含量都相比只用CaCl2礦化的絲素膜高。

表3 仿生礦化后的絲素膜表面元素含量Tab.3 Element contents of silk fibroin membrane surfaces after bionic mineralizction %

為更直觀地觀測絲素膜礦化后的變化，借助掃描電鏡對各個絲素膜的形貌變化進行觀察，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同礦化條件下絲素膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)(×300)Fig.7 Morphological structures of silk membranes under different mineralization conditions(×300)

從圖7可看出，未經(jīng)磷酸化處理的SF膜表面很光滑，經(jīng)過CaCl2/Na2HPO4交替礦化處理的SF膜表面變得很粗糙，有少量顆粒狀無機物生成，表明有磷酸鈣鹽或羥基磷灰石晶體生成，但其分布并不均勻。隨著磷酸化程度增加，SF/STP處理膜表面生成的羥基磷灰石晶體逐漸增多，且分布較均勻。礦化過程中用CaCl2/Na2HPO4處理的絲素膜表面生成的羥基磷灰石數(shù)目比僅用CaCl2處理的絲素膜要多，即絲素經(jīng)STP磷酸化后，提供了部分的磷酸根，從而為礦化過程提供了更多的沉積位點。

3 結(jié) 論

1)絲素蛋白在三聚磷酸鈉質(zhì)量為0.24 g、pH值為10、35 ℃條件下處理30 min，獲得了較好的磷酸化效果；絲素經(jīng)過磷酸化處理后，蛋白二級結(jié)構(gòu)和分子粒徑發(fā)生變化，磷酸化絲素膜對陽離子的吸附能力較空白樣增加。

2)采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑對絲素蛋白的力學(xué)與熱穩(wěn)定性有影響，當(dāng)磷酸化程度較高時，絲素膜材料的力學(xué)與熱力學(xué)性能發(fā)生不同程度的下降。

3)磷酸化絲素膜經(jīng)CaCl2/Na2HPO4交替礦化處理后，其表面較空白樣生成更多羥基磷灰石，采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑有利于絲素基仿生礦化材料的制備。

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