不同扁穗雀麥種質(zhì)苗期抗旱性鑒定與評(píng)價(jià)

趙文達(dá)，楊曉鵬，孫銘，張成林，伍文丹，馬 嘯，張新全

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

扁穗雀麥(Bromuscatharticus)為禾本科雀麥屬一年生或越年生草本植物，又名野麥子[1]。最早于20世紀(jì)90年代末引入我國(guó)，在內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等地表現(xiàn)為一年生，在我國(guó)西南和華中地區(qū)表現(xiàn)為越年生[2]。扁穗雀麥再生性和分蘗能力較強(qiáng)，產(chǎn)草量略低于多花黑麥草(Loliummultiflorum)，且具有一定的抗旱性，幼嫩時(shí)莖葉有軟毛，成熟時(shí)毛漸少，適口性僅次于黑麥草(Loliumperenne)和燕麥(Avenasativa)等。種子成熟后，莖葉仍為綠色，可保持較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其鮮草中家畜所需的必需氨基酸較豐富，賴氨酸含量較高，是解決我國(guó)冬春飼草缺乏的優(yōu)良牧草[2]。

水分在植物的生命活動(dòng)中起著重要的作用，許多植物在經(jīng)受干旱逆境后各項(xiàng)生理指標(biāo)均會(huì)受到一定的影響。植物苗期對(duì)水分的虧缺相當(dāng)敏感，在干旱環(huán)境下，植物的幼苗易出現(xiàn)死亡情況，對(duì)植物生長(zhǎng)和生物量的形成均有一定影響[3]。在牧草的生長(zhǎng)發(fā)育過程中同樣存在這種問題，所以水分也是制約牧草生物產(chǎn)量的重要因素[4]。扁穗雀麥起源于南美洲潘帕斯草原，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，具有一定的抗旱性，草產(chǎn)量較高，常做短期牧草種植，但在其在我國(guó)的適種地區(qū)如西南、華中地區(qū)為亞熱帶季風(fēng)氣候，冬春季節(jié)較為干旱，可能會(huì)影響扁穗雀麥出苗和生長(zhǎng)，并進(jìn)一步影響到牧草總產(chǎn)量。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于植物抗旱性特征的研究常通過測(cè)定干旱脅迫下植物的含水量、根冠比、干物質(zhì)、株高等形態(tài)和生理指標(biāo)，探究形態(tài)和生理指標(biāo)的變化與其抗性之間的關(guān)系[5-7]。因此，本研究在前期篩選出20% PEG-6000的模擬干旱濃度下，對(duì)處于苗期生長(zhǎng)的不同扁穗雀麥種質(zhì)連續(xù)72 h干旱脅迫后，比較不同種質(zhì)的葉片相對(duì)含水量(RWC)、相對(duì)電導(dǎo)率(REC)、丙二醛(MDA)含量、過氧化物酶活性(POD)、游離脯氨酸(Fpro)含量5項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化，綜合評(píng)價(jià)比較扁穗雀麥種質(zhì)的苗期抗旱性，對(duì)抗旱種質(zhì)的引種篩選和品種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試21份扁穗雀麥種質(zhì)資源，具體來源描述如表1所列。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將培養(yǎng)皿放置于90 ℃下消毒5 h，扁穗雀麥種子用HgCl2消毒[8]。將消毒后的21份扁穗雀麥種質(zhì)分別各取50粒種子進(jìn)行培育，將培養(yǎng)皿放置于25℃的培養(yǎng)箱中，每天澆水一次。發(fā)芽出苗后待供試材料長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)，將其移至錐形瓶。每個(gè)錐形瓶中放置5株材料，每份材料設(shè)置3個(gè)對(duì)照組，3個(gè)試驗(yàn)組，添加營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行12 h光照、12 h黑暗交替培養(yǎng)。待供試扁穗雀麥幼苗長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)，取部分植株進(jìn)行脅迫處理。脅迫處理采用PEG-6000溶于培養(yǎng)液，質(zhì)量濃度為20%，對(duì)照組繼續(xù)添加營(yíng)養(yǎng)液，脅迫處理72 h后，抽取一部分植株進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定[9]。每個(gè)指標(biāo)設(shè)置對(duì)照和處理，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

在脅迫處理和對(duì)照處理上各取4片展開葉，用蒸餾水沖洗葉片表面污物，并用吸水紙吸干葉片表面水分，進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)試。其中，葉片相對(duì)含水量采用飽和稱重法測(cè)定；相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率法測(cè)定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[10]；游離脯氨酸采用茚三酮法測(cè)定[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

各指標(biāo)的抗旱系數(shù)[12]和隸屬函數(shù)值[13]分別按照式(1)和式(2)進(jìn)行計(jì)算：

指標(biāo)性狀的抗旱系數(shù)=干旱脅迫下性狀指標(biāo)值/空白對(duì)照性狀指標(biāo)值;

(1)

μ(x)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin) 。

(2)

式(2)中：μ(x)為種質(zhì)材料性狀抗旱系數(shù)的隸屬函數(shù)值，若指標(biāo)與抗旱性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，則用1-μ(x)表示；X表示某一指標(biāo)的抗旱系數(shù)，Xmax和Xmin分別表示此種質(zhì)某一指標(biāo)抗旱系數(shù)的最大與最小值；且相對(duì)含水量、過氧化物酶活性和游離脯氨酸含量為正向指標(biāo)，相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量為負(fù)向指標(biāo)。

使用SPSS 20.0對(duì)抗旱系數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、多重比較、主成分分析、權(quán)重計(jì)算、抗旱性度量值計(jì)算和相關(guān)性分析。其中，方差分析和多重比較用來測(cè)試某一控制變量的不同水平是否給觀察變量帶來顯著差異，即測(cè)定供試種質(zhì)的各指標(biāo)抗旱系數(shù)的差異顯著性。主成分分析用來減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)集中的對(duì)方差貢獻(xiàn)最大的特征。權(quán)重是指某指標(biāo)在整體評(píng)價(jià)中的相對(duì)重要程度。權(quán)重越大則該指標(biāo)的重要性越高，對(duì)整體的影響就越高。在試驗(yàn)過程中以主成分分析中第一主成分的指標(biāo)特征值(取絕對(duì)值)為權(quán)重進(jìn)行計(jì)算?？购敌远攘恐凳怯酶髦笜?biāo)性狀的隸屬函數(shù)值與權(quán)重相乘后相加得到，能全面地比較供試材料的抗旱性。對(duì)兩個(gè)或多個(gè)具備相關(guān)性的指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，從而衡量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)間的相關(guān)密切程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 各性狀抗旱系數(shù)差異性分析

在干旱脅迫處理72 h后，測(cè)定供試材料的5個(gè)生理指標(biāo)(表2)。供試材料基于同一指標(biāo)的抗旱系數(shù)存在較明顯的變異，其中相對(duì)電導(dǎo)率與游離脯氨酸含量的抗旱系數(shù)變幅較大，其變異系數(shù)分別達(dá)到48.96%和42.61%，表明相對(duì)電導(dǎo)率與游離脯氨酸含量對(duì)干旱脅迫的敏感性在不同種質(zhì)間變異很高。同一材料不同指標(biāo)的抗旱系數(shù)也呈現(xiàn)出較大的差異，如種質(zhì)PI595114各指標(biāo)抗旱系數(shù)變幅為0.940 9～25.285 1，種質(zhì)PI217583各指標(biāo)抗旱系數(shù)變幅為0.931 4～4.964 7，表明不同指標(biāo)對(duì)干旱脅迫的敏感性差異較大。對(duì)比干旱脅迫前后的各生理指標(biāo)變化發(fā)現(xiàn)，相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、過氧化物酶活性和游離脯氨酸含量總體呈上升趨勢(shì)，相對(duì)含水量總體呈下降趨勢(shì)。

2.2 主成分分析

對(duì)多個(gè)指標(biāo)性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表3所列。前3個(gè)主成分的特征值累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了74.454%，可認(rèn)為其具有較強(qiáng)的信息代表性，提取的3個(gè)主成分基本上代表了5個(gè)原始指標(biāo)的絕大部分信息[14-15]。主成分1占據(jù)了原始數(shù)據(jù)信息的29.623%，且特征值較高，為1.481 1。主成分2與主成分3分別占原始數(shù)據(jù)信息量的24.389%和20.442%，特征值分別為1.219 4與1.022 0。在主成分1中起決定貢獻(xiàn)率大小的因素主要是相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率，即相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率的抗旱系數(shù)越大，主成分1的的貢獻(xiàn)率越高；主成分2中決定貢獻(xiàn)率大小的為相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、過氧化物酶活性、丙二醛含量的抗旱系數(shù)，主成分3中主要由丙二醛含量、相對(duì)含水量抗旱系數(shù)起決定作用。

2.3 各性狀隸屬函數(shù)值及抗旱性度量值

在計(jì)算抗旱性度量值之前，首先要計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重[16]。在主成分分析中，主成分1占據(jù)了原始數(shù)據(jù)信息的29.623%，因此，可以將主成分1中各性狀的特征向量作為權(quán)重進(jìn)行計(jì)算。利用公式(2)計(jì)算21份種質(zhì)各性狀抗旱系數(shù)的隸屬函數(shù)(表4)，5種指標(biāo)抗旱隸屬函數(shù)值的變異系數(shù)都超過了10%，其中相對(duì)電導(dǎo)率、POD活性抗旱隸屬函數(shù)值的變異系數(shù)超過了18%。將主成分1各抗旱系數(shù)的特征值占總特征值比例作為權(quán)重與對(duì)應(yīng)的隸屬函數(shù)值相乘，然后對(duì)不同種質(zhì)分別進(jìn)行乘積的求和，即可得到21份種質(zhì)的抗旱性度量值(表4)。種質(zhì)的抗旱性度量值越大，抗旱能力越強(qiáng)，反之則越弱。在21份種質(zhì)中，抗旱性度量值的變異系數(shù)達(dá)到了83.53%，PI442076抗旱性度量值最高，因此抗旱能力最強(qiáng)；PI292258抗旱性度量值最弱。

表2 21份扁穗雀麥種質(zhì)各生理指標(biāo)的抗旱系數(shù)Table 2 Drought resistance coefficients of 5 physiological indices of the 21 Bromus catharticus germplasms

同列不同字母表示不同種質(zhì)間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different germplasms at the 0.05 level.

表3 21份扁穗雀麥種質(zhì)資源指標(biāo)的抗旱系數(shù)主成分分析Table 3 Principal component analysis of drought tolerance coefficients of the 21 Bromus catharticus germplasms

*表示某指標(biāo)在各主成分中的最大絕對(duì)值。

* means the highest absolute value of each index in all factors.

表4 21份扁穗雀麥種質(zhì)的抗旱系數(shù)隸屬函數(shù)值和抗旱性度量值Table 4 The subordinate function values and drought-resistance values of Bromus catharticus germplasms

21份扁穗雀麥種質(zhì)不同指標(biāo)抗旱系數(shù)和抗旱性度量值之間的相關(guān)性大小(表5)表現(xiàn)為，游離脯氨酸含量>相對(duì)電導(dǎo)率>過氧化物酶活性>相對(duì)含水量>丙二醛含量，其中相對(duì)電導(dǎo)率的抗旱系數(shù)與抗旱性度量值呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.551，P<0.01)，游離脯氨酸含量的抗旱系數(shù)與抗旱性度量值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.572,P<0.01)，而過氧化物酶活性、丙二醛含量、相對(duì)含水量的抗旱系數(shù)與抗旱性度量值之間無顯著相關(guān)性。

2.4 聚類分析

為進(jìn)一步分析不同扁穗雀麥種質(zhì)的抗旱性優(yōu)劣，對(duì)21份材料的抗旱性度量值進(jìn)行聚類分析，將其分成不同耐旱型(圖1)。在歐式距離閾值為0.045時(shí)，可將21份扁穗雀麥種質(zhì)劃分為4類抗旱能力不同的群組：Ⅰ類包括江夏及抗旱性度量值最高的PI442076等4份種質(zhì)；Ⅱ類包括黔南等5份種質(zhì)；Ⅲ類包括3份種質(zhì)；Ⅳ類包括抗旱性度量值最小的PI292258等9份種質(zhì)。由各種質(zhì)的抗旱性度量值可以確定4類材料總體抗旱性強(qiáng)弱排序?yàn)棰?Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ，Ⅰ類抗旱性最強(qiáng)，各測(cè)定指標(biāo)表現(xiàn)優(yōu)異，4份種質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗旱能力；Ⅳ類抗旱性弱，各測(cè)定指標(biāo)表現(xiàn)較差。

同時(shí)，對(duì)分成的4個(gè)抗旱型群組進(jìn)行單因素方差分析(表6)，發(fā)現(xiàn)游離脯氨酸含量與相對(duì)電導(dǎo)率的隸屬函數(shù)值顯著差異(P<0.05)，相對(duì)含水量的隸屬函數(shù)值表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)；丙二醛含量、過氧化物酶活性的隸屬函數(shù)值差異不顯著(P>0.05)；平均隸屬函數(shù)值與抗旱性度量值均表現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

表5 抗旱系數(shù)和抗旱性度量值的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between drought tolerance coefficients of the 5 indices and drought-resistance values

*,P<0.05; **,P<0.01.

圖1 扁穗雀麥抗旱性度量值聚類分析Fig. 1 Clustering dendrogram of the 21 Bromus catharticus germplasms based on drought-resistance value

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫對(duì)植物的影響表現(xiàn)在多個(gè)方面，對(duì)于脅迫造成的壓力，生理代謝迅速做出調(diào)整以保證植物細(xì)胞能進(jìn)行正常的生理活動(dòng)[17]。在這個(gè)過程中滲透調(diào)節(jié)是植物抵抗干旱的主要方式，干旱環(huán)境下，植物體內(nèi)的水分減少，糖、氨基酸和無機(jī)離子等溶質(zhì)不斷積累，植物滲透勢(shì)降低，從而吸收水分，保持基本的生理活動(dòng)。因此，測(cè)定在干旱脅迫下植物的相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、過氧化物酶活性、游離脯氨酸含量等指標(biāo)，可有效評(píng)價(jià)植物苗期的抗旱能力。

當(dāng)在干旱脅迫下，牧草的生存和形成生物產(chǎn)量的能力下降，不同品種對(duì)干旱脅迫呈現(xiàn)出不同的抗性[18]。相對(duì)含水量降低的幅度愈小，牧草的抗旱能力就愈強(qiáng)，如多花黑麥草表現(xiàn)出抗旱性與相對(duì)含水量呈正相關(guān)關(guān)系[19]；而植物的相對(duì)電導(dǎo)率會(huì)隨著質(zhì)膜的選擇透性被破壞呈上升趨勢(shì)，與植物的抗旱能力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，植物體內(nèi)因干旱產(chǎn)生的丙二醛會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膜的損傷加劇，使細(xì)胞膜脂過氧化作用變強(qiáng)。因此，丙二醛含量增幅越高，植物的抗旱能力越弱[20]。過氧化物酶是一種保護(hù)性酶，對(duì)環(huán)境較為敏感，能夠清除植物體內(nèi)的活性氧，多數(shù)研究表明，在植物遭受逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的過氧化物酶活性會(huì)有所上漲[21]。游離脯氨酸除了作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)調(diào)節(jié)滲透外，還在穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性等方面其重要的作用，當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，游離脯氨酸的含量會(huì)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)[22]。本研究通過對(duì)脅迫下和非脅迫下扁穗雀麥種質(zhì)資源的相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、過氧化物酶活性、游離脯氨酸含量的研究發(fā)現(xiàn)，脅迫處理后相對(duì)含水量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、過氧化物酶活性、游離脯氨酸含量表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，與上述結(jié)論基本相符合。因此可以推斷扁穗雀麥通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的一些生理活動(dòng)如降低葉片含水量，增強(qiáng)酶活性來抵御水分脅迫對(duì)其帶來的不良影響[23]。

表6 扁穗雀麥種質(zhì)4個(gè)類組的各觀測(cè)指標(biāo)隸屬函數(shù)值的方差分析Table 6 Multiple comparisons of the subordinate function values of 4 clusters of Bromus catharticus germplasms

不同小寫字母和大寫字母表示相同指標(biāo)不同類組間差異顯著和極顯著(P<0.05和P<0.05);ns,表示差異不顯著。

Different lowercase and capital letters indicate significant difference between different groups in the same parameter at 0.05 and 0.01 levels, respectively; **,P<0.01; *,P<0.05; ns, not significant.

植物抗旱性受多個(gè)基因的控制，是多個(gè)指標(biāo)相互表達(dá)而呈現(xiàn)出的綜合性狀[24]。因此，單因素或單個(gè)性狀分析并不能有效分析出21份扁穗雀麥種質(zhì)的抗旱性強(qiáng)弱，需要綜合多個(gè)性狀，使單性狀分析抗旱性的片面性得到有效的補(bǔ)充，盡可能準(zhǔn)確的接近實(shí)際情況[25]。本研究通過測(cè)定多項(xiàng)生理指標(biāo)并結(jié)合隸屬函數(shù)分析及聚類分析，以抗旱性度量值來直觀定量表示其抗旱性強(qiáng)弱，并劃分了不同的抗旱型分組以對(duì)多個(gè)供試種質(zhì)進(jìn)行組群劃分。

綜上所述，供試21份扁穗雀麥種質(zhì)資源經(jīng)苗期模擬干旱脅迫，各項(xiàng)生理生化指標(biāo)都存在明顯差異。根據(jù)其抗旱性度量值，可將其分為4類不同的抗旱型，且抗旱性強(qiáng)弱順序?yàn)棰耦?Ⅱ類>Ⅲ類>Ⅳ類。材料PI442076的苗期抗旱性最強(qiáng)，材料PI292258的苗期抗旱性最弱，這為今后抗旱性品種選育及抗旱性分子機(jī)理研究提供了重要供試材料。