PAI-1(4G/5G)和ABCB1 C3435T基因與狼瘡繼發(fā)股骨頭壞死的相關(guān)性

李思佳,張 葵,鄭 艷,劉 薇,馮 媛,李 英,吳振彪

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床免疫科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:wuzhenbiao@fmmu.edu.cn)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是股骨頭血供受損或中斷,導(dǎo)致骨髓成分及骨細(xì)胞死亡,隨后發(fā)生修復(fù),繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變甚至塌陷的系列病理改變與臨床表現(xiàn)。其危險因素包括激素、酒精、創(chuàng)傷、凝血障礙、自身免疫性疾病等[1],其中激素誘發(fā)股骨頭壞死(GC-ONFH)最為常見。很多研究證實GC-ONFH患者對激素的敏感性存在異質(zhì)性,與基因多態(tài)性相關(guān)[2-5]。這些基因可以影響凝血及纖溶系統(tǒng),如PAI-1、MTHFR基因,很多研究發(fā)現(xiàn)PAI-1(4G/5G)、MTHFT C677T基因位點(diǎn)與GC-ONFH相關(guān)。有報道發(fā)現(xiàn)一些影響藥物代謝酶的基因也與GC-ONFH有關(guān),如CYP3A4、CYP3A5、CYP2D6,以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ABCB1、ABGC2,等)[6,7],上述基因可能使GC在體內(nèi)的代謝發(fā)生障礙,導(dǎo)致其毒副作用誘發(fā)骨壞死。目前以PAI-1(4G/5G)、ABCB1 C3435T作為GC-ONFH相關(guān)基因檢測應(yīng)用較為廣泛,其中PAI-1基因4G4G型、ABCB1 C3435T基因CC型為ONFH的高危型[8,9],在臨床檢驗用于GC-ONFH高危人群的篩查。

GC-ONFH中約31.2%-43.6%為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者[10]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種全身性自身免疫性疾病,可導(dǎo)致多系統(tǒng)組織損傷,激素在SLE的治療中發(fā)揮重要作用。SLE繼發(fā)骨壞死,發(fā)生率為5%-40%,以股骨頭壞死最為常見[11]。目前認(rèn)為SLE繼發(fā)ONFH(SLE-ONFH)不僅與應(yīng)用激素有關(guān),還與SLE原發(fā)病相關(guān)。有學(xué)者指出SLE繼發(fā)炎癥反應(yīng)、凝血異常、低補(bǔ)體以及SLE異常自身抗體如抗磷脂抗體、抗ds-DNA抗體均可能與ONFH相關(guān)[12],這些研究結(jié)論不盡一致,對臨床的指導(dǎo)價值有限。因此,PAI-1(4G/5G)、ABCB1 C3435T基因能否作為SLE-ONFH的篩查指標(biāo)有著重要的臨床價值,且目前國內(nèi)未見文獻(xiàn)報道。本研究對SLE-ONFH的患者進(jìn)行PAI-1(4G/5G)、ABCB1 C3435T基因相關(guān)性分析,為其可能作為SLE-ONFH早期診斷的指標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)及分組

選擇2016-06～2017-06符合2012年系統(tǒng)性紅斑狼瘡國際臨床合作組(SLICC)分類標(biāo)準(zhǔn)的SLE病人,18-65歲,激素用量上應(yīng)至少滿足以下之一:起始量強(qiáng)的松≥30 mg/d,或累積量>10 g,或沖擊治療(甲潑尼龍500 mg或1 000 mg×3 d)。由影像科專業(yè)醫(yī)師對患者的影像圖片進(jìn)行閱片,X線、CT、MRI至少一項符合ONFH影像學(xué)表現(xiàn)的SLE患者為SLE-ONFH組,同期進(jìn)行基因檢測的SLE患者為對照組。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 離心機(jī);熒光檢測儀-TL998A型(北京天龍科技有限公司);PHARM-GENE 01 SNP分析保存液(商品名:耀金保),用于進(jìn)行SNP分析前對血液、組織標(biāo)本的保存。PHARV-GENE 200 SNP分析樣本處理試劑(商品名:耀金分),用于熒光染色原位雜交及染色體核型分析、化學(xué)藥物用藥指導(dǎo)時的樣本分析。氯化銨溶液(北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司)。

1.2.2 檢測方法 在1.5 ml離心管中加入1 ml×NH4Cl預(yù)處理液(NH4Cl溶液與滅菌用水體積比1 ∶9),取200 μl混勻的臨床全血,加入對應(yīng)編號的NH4Cl預(yù)處理液離心管中,上下顛倒10次,室溫靜置5 min,混勻后液體色會逐漸變?yōu)槌吻宓募t色;放入離心機(jī),室溫3 000 r/min,5 min,將上層透明紅色液體吸取干凈,注意避免吸走沉淀在管底的白細(xì)胞;向富集有白細(xì)胞的離心管中加入50 μl PHARM-GENE 01 SNP分析保存液,反復(fù)吹打混勻。室溫靜置20-30 min,期間顛倒混勻2次,待檢測。根據(jù)需要檢測的基因位點(diǎn),取出相應(yīng)PHARV-GENE 200 SNP,并將樣本編號標(biāo)注在試劑管上;向相應(yīng)編號的PHARV-GENE 200 SNP試管中加入1.5 μl處理后的白細(xì)胞樣本;蓋緊管蓋,置入熒光檢測儀;采用熒光染色原位雜交及染色體核型分析系統(tǒng)自動判讀熒光信號值,獲取熒光曲線圖,進(jìn)行PAI-1(4G/5G)、ABCB1 C3435T基因分析。結(jié)果判讀:PAI-1(4G/5G)基因4G4G型為高危型,4G/5G、5G5G型為低危型;ABCB1C3435T基因CC型為高危型,CT、TT型為低危型。

1.3 統(tǒng)計方法

用SPSS 13.0軟件對臨床資料進(jìn)行分析,計量資料用t檢驗比較,兩組基因型差異比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 SLE-ONFH組與對照組骨壞死及激素應(yīng)用情況

SLE-ONFH組共19例患者(女/男=18/1),平均年齡33.4歲,平均激素起始量為36.9 mg/d,17例激素累積量大于10 g,4例行激素沖擊治療,13例累及雙側(cè)股骨頭,9例合并狼瘡腎炎;對照組共21例(女/男=19/2),平均年齡31.9歲,平均激素起始量為35.7 mg/d,18例激素累積量大于10 g,2例行激素沖擊治療,5例合并狼瘡腎炎。兩組之間各指標(biāo)比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

表1 SLE-ONFH組與對照組的SLE患者激素用量及一般情況Table 1 Hormone dosage and clinical data of SLE patients

2.2 兩組間PAI-1(4G/5G)的基因型比較

SLE-ONFH組6例SLE患者PAI-1(4G/5G)基因為4G4G型,陽性率為31.6%;對照組3例SLE患者PAI-1(4G/5G)基因為4G4G型,陽性率為14.3%。SLE-ONFH組與對照組PAI-1基因4G4G型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 兩組間ABCB1 C3435T基因型比較

SLE-ONFH組10例SLE患者ABCB1 C3435T基因為CC型,陽性率為52.6%;對照組4例SLE患者ABCB1 C3435T基因為CC型,陽性率為19.0%;SLE-ONFH組ABCB1 C3435T基因CC型明顯多于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.94,P<0.05,見表2)。

表2 SLE-ONFH與對照PAI-1 4G/5G基因型與ABCB1 C3435T基因型分析Table 2 Genotype analysis of PAI-1 4G/5G and ABCB1 C3435T in SLE-ONFH and SLE controls

3 討論

PAI-1(4G/5G)和ABCB1 C3435T基因是GC-ONFH的相關(guān)基因,但是否與SLE-ONFH相關(guān)尚無定論,本研究對SLE-ONFH患者進(jìn)行PAI-1(4G/5G)和ABCB1 C3435T基因檢測,初步證實ABCB1 C3435T基因與SLE-ONFH存在相關(guān)性。

纖溶酶激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1))基因啟動子區(qū)4G/5G多態(tài)性與血漿PAI-1活性有密切相關(guān)性,PAI-1 4G4G型會導(dǎo)致血漿PAI-1升高,從而影響凝血及纖溶系統(tǒng),可導(dǎo)致凝血障礙、血管閉塞。很多文獻(xiàn)報道激活的血管內(nèi)凝血可使骨內(nèi)血栓形成和骨壞死,是非創(chuàng)傷骨性壞死的潛在危險因子之一[13-15]。本研究結(jié)果提示SLE-ONFH組PAI-1基因4G4G型的陽性率與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。我們認(rèn)為可能與以下因素相關(guān):①SLE疾病本身可能與PAI-1基因相關(guān),使對照組PAI-1 4G4G基因型頻率有所升高。有研究發(fā)現(xiàn)SLE心血管受損的患者外周血PAI-1水平明顯升高[16],間接提示SLE本身也可能出現(xiàn)PAI-1基因4G4G型的高表達(dá);②PAI-1基因與其他疾病具有相關(guān)性,如冠狀動脈疾病及其他血栓類疾病,也有報道證實PAI-1(4G/5G)基因可能是IgA腎病病情加重的危險因素[17-19];③其他影響因素:SLE-ONFH可能與SLE繼發(fā)炎癥反應(yīng)、凝血異常、低補(bǔ)體以及抗磷脂抗體、抗ds-DNA抗體相關(guān)[12],本研究未能將其納入到觀察指標(biāo);④由于樣本量偏少,僅觀察到兩組間PAI-1(4G/5G)基因具有統(tǒng)計學(xué)差異的趨勢。

ABCB1基因編碼的ABCB1參與調(diào)控P糖蛋白(P-gp),后者可以轉(zhuǎn)運(yùn)許多合成類激素,影響激素在體內(nèi)的吸收和分布[19]。研究報道ABCB1 C3435T基因多態(tài)性與GC-ONFH的發(fā)生相關(guān),ABCB1 C3435T基因CC型(野生型者)比TT型(突變者)的風(fēng)險高2-3倍[9,20]。本研究首次將ABCB1 C3435T基因檢測應(yīng)用于SLE-ONFH人群,并從實驗設(shè)計上除外了激素用量不等帶來的偏移,結(jié)果提示SLE-ONFH組人群ABCB1 C3435T基因CC型的陽性率顯著高于對照組,證明ABCB1 C3435T基因與SLE-ONFH存在相關(guān)性(P<0.05),為ABCB1 C3435T基因檢測用于SLE-ONFH高危人群早期的篩查提供了理論依據(jù)。此外,我們發(fā)現(xiàn)SLE-ONFH組中出現(xiàn)狼瘡腎炎的發(fā)生率明顯多于對照組(47.4%vs23.8%),然而狼瘡腎炎與SLE-ONFH是否具有相關(guān)性,目前暫無相關(guān)文獻(xiàn)報道,需進(jìn)一步研究。

綜述所述,本研究旨在發(fā)現(xiàn)PAI-1(4G/5G)基因和ABCB1 C3435T基因與SLE-ONFH的相關(guān)性,結(jié)果表明ABCB1 C3435T基因與SLE-ONFH相關(guān),可能成為SLE-ONFH高危人群早期篩查的指標(biāo)之一。PAI-1(4G/5G)基因與SLE-ONFH雖無相關(guān)性,我們認(rèn)為擴(kuò)大樣本量、納入更多的臨床指標(biāo),有助于進(jìn)一步了解PAI-1基因與SLE-ONFH的關(guān)系。