新型循環(huán)提取方法研究miRNA-21在NSCLC中的預(yù)測(cè)價(jià)值

榮 昊，任偉宏，李延卿，何 鑫，馮 倩，李文博，馮慧潔

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450000；2，河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450000)

肺癌是全世界范圍內(nèi)癌癥的首要死因，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌病死率的85%[1]。在NSCLC發(fā)病早期做出正確診斷的患者5年生存率明顯較高，但大多數(shù)肺癌都是因?yàn)槌霈F(xiàn)明顯癥狀才被發(fā)現(xiàn)，而此時(shí)疾病已經(jīng)發(fā)展到中晚期，有大約10%的NSCLC患者在初診時(shí)即已出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，且平均生存期僅有4個(gè)月[2]。與應(yīng)用乳腺X線檢測(cè)乳腺癌或者應(yīng)用結(jié)腸鏡檢測(cè)結(jié)腸癌不同，除了病理活檢并沒(méi)有可靠的手段用于NSCLC的早期診斷。因此，越來(lái)越多的研究專注于尋找NSCLC的早期生物標(biāo)志物[3-4]。

外泌體是一種極其微小的納米級(jí)囊泡結(jié)構(gòu)，其直徑范圍在30～100 nm[5-6]。研究證實(shí)，任何細(xì)胞均可以以胞吐的形式釋放出外泌體，但腫瘤細(xì)胞的外泌體釋放量遠(yuǎn)超正常細(xì)胞，并且可以穩(wěn)定存在于各種體液中，如血液、汗液、尿液、精液、胸腔積液和腹水。在外泌體最開(kāi)始被發(fā)現(xiàn)時(shí)一度被認(rèn)為是“垃圾袋”，當(dāng)時(shí)人們認(rèn)為細(xì)胞通過(guò)外泌體這種“垃圾袋”將其自身不需要的廢料排出體外[7]。然而近幾年來(lái)人們通過(guò)對(duì)外泌體的不斷探索，逐漸認(rèn)識(shí)到它的巨大價(jià)值，尤其是對(duì)于腫瘤研究方面，外泌體可以對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，并通過(guò)促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成加速腫瘤生長(zhǎng)，甚至可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤藥物抵抗[8-10]。此外，外泌體還特異性地包含mRNA、miRNA、dsDNA和蛋白質(zhì)，可以作為不同腫瘤的診斷、預(yù)測(cè)和預(yù)后的生物標(biāo)志物。更重要的是，外泌體可以被理解為細(xì)胞間的信息傳遞介質(zhì)，它的內(nèi)容物與腫瘤母細(xì)胞具有高度一致性，為腫瘤細(xì)胞特征的分析提供了一條新的途徑。

在外泌體的眾多內(nèi)容物中，miRNA是被研究最多的分子，miRNA是微小的非編碼RNA，它通過(guò)結(jié)合其靶mRNA的3′UTR來(lái)調(diào)節(jié)基因，導(dǎo)致靶基因表達(dá)的改變，通過(guò)這種方式，單個(gè)miRNA就可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。miRNA在外泌體的保護(hù)下穩(wěn)定地存在于血液中并不受RNase的降解，因此可以廣泛地應(yīng)用于癌癥研究。在外泌體包含的眾多miRNA中，miRNA-21在NSCLC患者外泌體中的異常表達(dá)被廣泛研究。相關(guān)文獻(xiàn)指出，在NSCLC中，表達(dá)水平較健康人明顯上調(diào)的miRNA有miRNA-21、miRNA-205和miRNA-155，尤其以miRNA-21上調(diào)最為明顯[11-14]。因?yàn)檠褐械耐饷隗wmiRNA水平與它們?cè)诮M織中的水平呈正相關(guān)，所以研究血清外泌體miRNA-21的表達(dá)水平對(duì)于了解NSCLC腫瘤組織中miRNA-21的表達(dá)水平，以及進(jìn)一步研究腫瘤機(jī)制至關(guān)重要[14-15]。因此，本研究選取血清外泌體miRNA-21為目標(biāo)RNA，研究其對(duì)于預(yù)測(cè)NSCLC患病風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值，及其與NSCLC病理、臨床特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 血清標(biāo)本收集于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，標(biāo)本采集過(guò)程經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。試驗(yàn)組為NSCLC患者血清30例，對(duì)照組為體檢健康者血清10例。血清4 ℃冷藏保存。

1.2儀器與試劑 外泌體提取試劑盒PureExo?Exosome Isolation Kit(P101)購(gòu)自美國(guó)101Bio公司；外泌體RNA提取試劑盒SeraMir Exosome RNA Amplification(140710-002)購(gòu)自美國(guó)SBI公司；血清RNA提取試劑盒miRcute miRNA Isolation Kit(DP501)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Syntesis Kit(KR211-02)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)(FP411-02)、miRNA檢測(cè)外參(CR100-1)、miRNA外參檢測(cè)引物(CD200-01)、miRNA-21檢測(cè)引物(CD201-0092)均購(gòu)自天根生化科技有限公司。ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)、低溫高速離心機(jī)為美國(guó)Thermo Fisher科技公司產(chǎn)品；透射電鏡JEM-1400為日本電子株式會(huì)社(JEOL)產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1分離血清外泌體 取每例受試者血清標(biāo)本400 μL，共計(jì)40例，設(shè)為A組，按照外泌體提取試劑盒PureExo?Exosome Isolation Kit(P101)說(shuō)明書(shū)提取血清外泌體；將分離出的外泌體懸于PBS溶液中，置于4 ℃冰箱以備下一步操作。

1.3.2透射電子顯微鏡下驗(yàn)證外泌體形態(tài) 吸取30 μL分離純化后的外泌體懸液加于載樣銅網(wǎng)上，待網(wǎng)孔吸收后干燥10 min；加入20 μL洗液進(jìn)行洗滌；重復(fù)洗滌后加入10 μL的電鏡溶液，作用10 min；洗滌2次，在室溫下干燥過(guò)夜；電鏡下成像。

1.3.3提取外泌體RNA 按照外泌體RNA提取試劑盒seraMir Exosome RNA Amplification說(shuō)明書(shū)要求提取血清外泌體中RNA；每例血清外泌體應(yīng)當(dāng)獲得30～40 μL外泌體RNA；提取的外泌體RNA -70 ℃保存。

1.3.4提取血清RNA 再取每例受試者血清標(biāo)本400 μL，共計(jì)40例，設(shè)為B組，按照血清RNA提取試劑盒miRcute miRNA Isolation Kit說(shuō)明書(shū)要求提取血清RNA；提取的血清RNA不應(yīng)少于15 μL，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5miRNA-21表達(dá)水平檢測(cè) 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Syntesis Kit對(duì)A、B兩組RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA，條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。再使用熒光PCR擴(kuò)增試劑盒miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95 ℃15 min預(yù)變性；94 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，此步驟進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，目的是富集低豐度目標(biāo)miRNA；94 ℃ 20 s變性，60 ℃退火延伸，此步驟進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)末尾收集熒光?；蛩讲捎檬?-ΔΔCt法計(jì)算，Ct值為標(biāo)本曲線與閾值線交叉點(diǎn)的橫坐標(biāo)，ΔΔCt=(試驗(yàn)組CtmiRNA-21-試驗(yàn)組Ct外參)-(對(duì)照組CtmiRNA-21-對(duì)照組Ct外參)，此處的對(duì)照組規(guī)定為miRNA-21表達(dá)最低的一組。

2 結(jié) 果

2.1透射電子顯微鏡觀察分離出的血清外泌體 透射電子顯微鏡下觀察結(jié)果如圖1所示，通過(guò)外泌體提取試劑盒PureExo?Exosome Isolation Kit(P101)分離得到的外泌體徑粒大小均約為40 nm，呈囊泡狀。

2.2A組與B組miRNA-21的表達(dá)水平比較 A組中，miRNA-21在NSCLC患者和體檢健康者血清中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而在B組中，NSCLC患者血清外泌體中miRNA-21的表達(dá)水平較體檢健康者明顯上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為2.93倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3血清外泌體miRNA-21預(yù)測(cè)NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線 對(duì)B組miRNA-21表達(dá)水平進(jìn)一步行ROC曲線分析，結(jié)果表明血清外泌體miRNA-21預(yù)測(cè)NSCLC風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值高，曲線下面積為86.7%(P<0.05)，95%CI為0.721～1.000。當(dāng)miRNA-21表達(dá)水平為54.71時(shí)，可得出最佳靈敏度(86.7%)和特異度(90.0%)，見(jiàn)圖2。

表1 A、B兩組中體健康者與NSCLC患者miRNA-21表達(dá)水平

圖2 血清外泌體miRNA-21預(yù)測(cè)NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線

2.4NSCLC患者血清外泌體miRNA-21表達(dá)水平與病理、臨床特征的關(guān)系 NSCLC患者血清外泌體miRNA-21表達(dá)水平與病理分期、TNM分期有相關(guān)性(P<0.05)，與病理分型無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 NSCLC患者血清外泌體miRNA-21表達(dá)水平與病理分型、病理分期、TNM分期的關(guān)系

3 討 論

人體內(nèi)的循環(huán)miRNA之所以可以在外周血中穩(wěn)定存在，是因?yàn)楸晃⑴?、外泌體等囊泡包裹，或者與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，免于受到血液中核糖核酸酶的降解，以及血液溫度、酸堿度等不利因素的干擾[16-18]。常規(guī)的提取循環(huán)miRNA的方法是首先裂解包裹miRNA的膜結(jié)構(gòu)，再提取釋放入血清的游離miRNA，但miRNA性質(zhì)極其不穩(wěn)定，一旦釋放入血液必定受到各種干擾因素的降解，影響提取效率，因此，有報(bào)道指出全血miRNA可能并不適用于篩選NSCLC[19]。針對(duì)以上問(wèn)題，本項(xiàng)研究提出首先從血清中分離出外泌體，這就使得miRNA在被提取之前就已經(jīng)隨外泌體脫離血清，故可大大提高提取效率。

從另一個(gè)角度來(lái)講，雖然所有細(xì)胞都可以分泌外泌體，但腫瘤細(xì)胞的外泌體釋放量遠(yuǎn)超正常細(xì)胞，因此，癌癥患者血清外泌體絕大部分來(lái)自于腫瘤細(xì)胞，在組成成分(包括蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、miRNA等)上與腫瘤母細(xì)胞保持高度一致性[20]。提取血清外泌體來(lái)代替腫瘤組織進(jìn)行相關(guān)癌癥研究，正是時(shí)下的三大液體活檢技術(shù)之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miRNA-21高水平表達(dá)是NSCLC患病的高危預(yù)測(cè)因素，這與NSCLC腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中的結(jié)果一致，而如果直接從血清中檢測(cè)miRNA-21的表達(dá)水平，體檢健康者和NSCLC患者沒(méi)有差異[14-15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清外泌體miRNA-21表達(dá)水平與病理分期、TNM分期相關(guān)，miRNA-21表達(dá)水平隨著腫瘤細(xì)胞惡性程度的增高以及癌癥病情的發(fā)展而升高。筆者推測(cè)，其機(jī)制可能是miRNA-21抑制細(xì)胞的分化并誘導(dǎo)細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，并且在癌癥進(jìn)程中，miRNA-21進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。但是，NSCLC患者血清外泌體miRNA-21表達(dá)水平與病理分型不相關(guān)，這就提示在肺腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌腫瘤組織中miRNA-21表達(dá)水平無(wú)差異。

本研究存在一些不足之處，選取樣本量較少，還需在接下來(lái)的研究中擴(kuò)大樣本量以進(jìn)一步驗(yàn)證本文結(jié)果；本研究?jī)H選取了NSCLC這一個(gè)癌癥病種，沒(méi)有涉及其他癌癥類型的研究，故血清外泌體miRNA-21表達(dá)量升高在預(yù)測(cè)NSCLC風(fēng)險(xiǎn)中的特異性有待考證；對(duì)于miRNA-21在NSCLC疾病發(fā)展中的作用機(jī)制僅僅作出了推測(cè)，同樣需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

外泌體是一個(gè)相對(duì)較新的研究領(lǐng)域，許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)對(duì)這個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生了興趣，并且發(fā)表了許多頗有見(jiàn)解的文章，然而至今為止卻尚未建立一個(gè)成熟的分離和分析方案，對(duì)于如何很好地應(yīng)用外泌體也缺乏共識(shí)。這些事實(shí)表明，在了解外泌體的功能作用方面還有很長(zhǎng)的路要走，我們需要進(jìn)一步研究外泌體的內(nèi)容物如miRNA如何作用于腫瘤細(xì)胞，以及如何在癌癥的診斷和預(yù)后中發(fā)揮作用，并通過(guò)對(duì)外泌體miRNA的研究來(lái)幫助我們理解癌癥的機(jī)制，最終指導(dǎo)臨床靶向用藥。