一種用于數(shù)字PCR的微流控芯片的設計、制作和性能驗證

任曉龍，李 增*，許少飛

（1.廣東順德工業(yè)設計研究院 廣東佛山528300；2.廣東順德永諾生物科技有限公司 廣東佛山528300）

0 引 言

微流控芯片技術是將生物和化學實驗室的基本功能微縮到幾平方厘米的芯片上[1]，在同一芯片上設計不同微流路溝道流型實現(xiàn)不同試劑的混合反應，減少繁瑣的生物實驗操作步驟，縮短檢測所需時間[2]，由于芯片產(chǎn)生的分散相均勻地被連續(xù)相隔離開來，解決了傳統(tǒng)技術上交叉污染的問題。此外微滴形態(tài)穩(wěn)定、易操作并可以快速大量地獲得使它成為微反應器的理想選擇。微流控芯片技術已成為多學科交叉的科學技術平臺，目前應用于包括核酸分析、蛋白質(zhì)分析和代謝物分析在內(nèi)的重要領域生物化學分析?？捎糜谥谱餍酒牟牧现饕袉尉Ч?、無定型硅、玻璃、金屬和有機聚合物[3]，與玻璃和石英相比，有機聚合物具有優(yōu)良的光學特性、生物兼容性、氣體通透性以及較低的制作成本等特點，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、工程塑料、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚苯乙烯（polystyrene）和環(huán)烯烴共聚物（COC）等[4]。本次實驗所用芯片為PDMS芯片和COC芯片，PDMS芯片利用模塑的方法制得，COC芯片利用注塑的方法制得。由于環(huán)烯烴聚合物具有優(yōu)良的光學性能和較高的生物相容性，表面易于修飾、尺寸穩(wěn)定和較高的疏水性，且分子結(jié)構(gòu)中不含氧、氮等原子，不存在未飽和的雙鍵、三鍵及芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，其化學性質(zhì)穩(wěn)定，利用注塑的方法加工該芯片更易于大批量標準化生產(chǎn)，降低了芯片的制作和實驗操作成本。

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種體外酶促合成擴增特定DNA片段的方法，液滴式數(shù)字PCR（ddPCR）是利用微流控芯片產(chǎn)生液滴并以液滴作為PCR反應器的一種高效的數(shù)字 PCR平臺方法[5]。其原理是將待測樣品分配到由芯片產(chǎn)生的數(shù)百萬個液滴中，使得每個液滴中最多含有一個拷貝的樣品分子，與實時熒光定量 PCR相對定量的方法不同，ddPCR反應后液滴中有熒光顯示則說明含有樣品分子（記為 1），無熒光顯示則說明不含有樣品分子（記為 0）[6]，通過統(tǒng)計含有熒光信號的液滴數(shù)量（即初始樣品的拷貝數(shù)）而實現(xiàn)對核酸的絕對定量。與傳統(tǒng)定量PCR技術相比，數(shù)字 PCR方法不受擴增效率的影響、不必建立標準曲線[7]、不依賴于擴增曲線的循環(huán)閾值（CT值）實現(xiàn)絕對定量。目前市場上常見的數(shù)字 PCR系統(tǒng)主要有美國伯樂bio-rad QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)、美國ABI QuantStudio 3D 數(shù)字 PCR系統(tǒng)和美國RainDance皮升級微滴數(shù)字 ddPCR系統(tǒng)（Raindrop digital PCR System）。

1 芯片設計與制作

1.1 材料與儀器

材料：硅片、光刻膠（MicroChem）、顯影液（MicroChem）、PDMS預聚物（道康寧）、載玻片、Ni基片、丙酮。

儀器：臺式勻膠機、保溫箱、等離子清洗機、URE-2000型系列i線深度曝光光刻機（中國科學院光電技術研究所）、FANUCα-2000I50B注塑機（日本）。

1.2 芯片的設計

隨著微流控芯片的發(fā)展其功能越來越多，通道結(jié)構(gòu)也越來越復雜，常用的結(jié)構(gòu)有正交結(jié)構(gòu)[8]、流式聚焦[9]和共軸流[10]。圖1為本實驗所設計的十字交叉型微通道結(jié)構(gòu)圖，其中 1為油相入口，2為水相入口，3為流體出口。樣品管道寬度為 20μm，油相管道寬度為 15μm，a處為油相和水相的十字型剪切口，管道寬度為 20μm，深度為 30μm。水相樣品和油相在壓力的驅(qū)動下流經(jīng)十字口處，在剪切力的作用下水相樣品被油相分割成均勻的油包水結(jié)構(gòu)，在收集腔內(nèi)獲得一定直徑的微滴。

圖1 微型通道結(jié)構(gòu)Fig.1 Microchannel structure

1.3 PDMS芯片的制作

本實驗中所用 PDMS芯片通過模塑法加工制得。首先將 CAD軟件繪制的芯片微通道結(jié)構(gòu)圖形加工成掩膜版。然后用勻膠機在處理后的硅基片上均勻地涂覆一層厚度為30μm的SU-8 2050光刻膠（圖2a）；經(jīng)過紫外曝光將掩膜版上的圖形轉(zhuǎn)移至光刻膠上（圖 2b）；顯影后用丙酮除去多余的光刻膠，在保溫箱中烘干 30s便得到用于制備芯片的陽模（圖 2c）；將 PDMS預聚物與固化劑按體積比 10∶1量取，攪拌均勻并經(jīng)過真空脫氣后倒在預先準備好的帶有圍堰結(jié)構(gòu)的陽模上（圖 2d）；在保溫箱中 65℃保 溫 2h使其充分固化（圖 2e）；將固化的 PDMS基片從陽模上剝離下來進行打孔，與潔凈的載玻片進行等離子體鍵合（圖 2f），在打孔處封裝聚四氟乙烯管以便于進樣和連接恒壓泵，從而制得所需要的 PDMS-玻璃芯片（圖 3）。

1.4 COC芯片的制作

COC芯片的制作過程主要包括模具的制作和注塑成型 2步，在模具制作中主要是模芯的加工，首先將CAD軟件繪制的芯片微通道結(jié)構(gòu)圖形加工成掩膜版，然后用勻膠機在處理后的 Ni基片上均勻涂覆一層厚度為 30μm 的正光刻膠，通過紫外曝光使得掩膜版上的圖形轉(zhuǎn)移至光刻膠上。顯影后便可獲得具有微通道結(jié)構(gòu)的凹模，將凹模和鎳金屬塊分別裝夾在微電鑄槽的陰極和陽極中，在伴有超聲波攪拌[11]的條件下進行電鑄，使得在陰模上沉積出所需高度的鎳。電鑄完成后，取出陰模并除去殘余的光刻膠，對微結(jié)構(gòu)進行拋光研磨等后處理，從而制得加工芯片的模芯（圖 4）。

圖2 PDMS芯片陽模的制作流程Fig.2 Fabrication process of PDMS positive modulus

圖3 自制PDMS-玻璃芯片F(xiàn)ig.3 Self-made PDMS-glass Chip

將加工好的模具裝夾在注塑機上，調(diào)整模具閉合高度、壓力等參數(shù)，然后將 COC材料顆粒放入注塑機中，調(diào)節(jié)注塑機溫度、注射速度和保壓時間等參數(shù)，在螺桿的推動下熔融狀態(tài)的 COC進入模具，冷卻后脫模得到含有微通道結(jié)構(gòu)的芯片結(jié)構(gòu)層。將芯片結(jié)構(gòu)層與另一COC塑料片進行熱壓鍵合后便可獲得所要的COC芯片（圖5）。

圖4 模具模芯Fig.4 Mold core

圖5 COC芯片F(xiàn)ig.5 COC chip

2 實驗

2.1 試劑與儀器

試劑：人體 EGFR基因質(zhì)粒由實驗室自制并采用 Qubit對質(zhì)粒進行定量，上游引物 5′-GCAGCATG TCAAGATCACAGATT-3′、下游引物 5′-CCTCCTTC TGCATGGTATTCTTTCT-3′、FAM 探針 5′-FAM-CA GTTTGGCCAGCCCA-MGB-NFQ-3′均 由 Thermo Fisher（美國）合成，DNA聚合酶購自生工生物（上海）。

儀器：ABI普通 PCR 儀、恒壓泵（MS-PC-6）、IX73-F22FL/PH熒光倒置顯微鏡（Olympus）、保溫箱、光學檢測平臺。

2.2 微滴的生成

配制 ddPCR反應體系：取 10μL自制 ddPCR mix，將 FAM 探針和引物用無菌去離子水分別稀釋到 0.5μmol/L 和 1.8μmol/L，F(xiàn)AM 探針 0.5μL，上游引物1.8μL，下游引物1.8μL，gDNA模板2μL，加入無菌去離子水補足至 20μL。將 COC芯片置于光學檢測平臺，使用移液槍移取配制好的 PCR反應體系15μL至COC芯片水相孔中，在油相孔中加入50μL微滴生成油，連接壓力泵，調(diào)節(jié)油相管道壓力40kPa，水相管道壓力 25kPa，正壓進樣，當液體流經(jīng)十字交叉處時被油相液體切割在管道內(nèi)生成扁圓形微滴，在收集腔內(nèi)形成圓形微滴（圖 6），將收集腔中生成的微滴放置在 PCR儀上進行擴增，并同時檢測生成微滴的脈寬和熒光值的穩(wěn)定性。

圖6 COC芯片生成微滴Fig.6 Microdroplets generated by COC chip

數(shù)字 PCR反應條件：首先 95℃加熱 10min充分變性，隨后 95℃加熱 30s變性，60℃退火延伸1min，經(jīng)過 40個循環(huán)進行擴增，最后 95℃加熱10min變性，4℃保存。

在相同條件下以相同的方法利用 PDMS芯片進行微滴生成（圖7）并檢測生成微滴脈寬和熒光值的穩(wěn)定性。

圖7 PDMS芯片生成微滴Fig.7 Microdroplets generated by PDMS chip

2.3 微滴的梯度分析

數(shù)字PCR對目標分子定量的動態(tài)范圍是評價該方法分析性能的一項重要指標，根據(jù)泊松分布（Poisson distribution）理論獲得每個液滴中包含目的基因的個數(shù)K的概率為：

該式中λ為液滴中的平均模板數(shù)，當λ＜0.3時才可確保大部分微單元含有數(shù)量不多于1的DNA模板，因此生成微滴的數(shù)目是數(shù)字PCR技術絕對定量的重要保障[12]。將含 gDNA 定量并按 10倍梯度稀釋得到101～106copies/μL 的濃度梯度樣本，通過λ和每個平行PCR反應的體積和所有平行反應的數(shù)目以及可計算出每個反應中所含樣品DNA的絕對濃度[13]，統(tǒng)計不同濃度的gDNA的定量結(jié)果。

2.4 結(jié)果分析

在微滴生成實驗中，液滴直徑隨水相進樣口處的壓力增加而增大，當水相的流速越大時所需要剪切力越大，因此在芯片結(jié)構(gòu)不變的情況下，可通過調(diào)節(jié)進樣口壓力值的大小控制水相和油相的流速來獲得一定直徑大小的微滴。本次試驗中通過調(diào)節(jié)油相壓力40kPa和水相壓力25kPa生成液滴直徑為40μm，通過統(tǒng)計陽性微滴的數(shù)目可知 15μL的 PCR試劑在PDMS芯片中 7min可生成 4×105個微滴；COC芯片 4min內(nèi)可生成 4×105個微滴。將 2種芯片生成的微滴放在熒光倒置顯微鏡下觀察均呈現(xiàn)良好的球形，液滴界限明顯。進一步檢測 2種芯片生成微滴脈寬的 CV 值（圖 8）和熒光值的 CV 值（圖 9）表明，COC芯片生成微滴的穩(wěn)定性均較好于PDMS芯片。

圖8 微滴脈寬CV值Fig.8 Microdrop pulse width CV value

圖9 微滴熒光峰值CV值Fig.9 Microdrop fluorescence value CV value

通過數(shù)字PCR對核酸分子進行絕對定量的關鍵在于模板有限稀釋、單分子 PCR擴增和泊松分布統(tǒng)計[14]。將稀釋后的樣品進行 PCR擴增，含有目標分子樣品室會產(chǎn)生強烈的熒光信號被檢測出來，對于其他雜質(zhì)分子由于引物的不匹配或熒光探針具有序列特異性，產(chǎn)生的信號很微弱，并不影響統(tǒng)計結(jié)果。

通過在熒光倒置顯微鏡上觀察可知，當樣品濃度在 106copies/μL以上時，陽性液滴的數(shù)目基本達到飽和，隨著模板濃度的降低陽性液滴的數(shù)目逐漸變少，通過進行質(zhì)粒實際檢測濃度與理論濃度的回歸分析（圖 10）可知，DNA 模板濃度在 101～106copies/μL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系（R2＝0.9983）。

3 結(jié) 論

微流控技術是一種快速高效的微分析技術，用于數(shù)字PCR技術可實現(xiàn) DNA單分子反應和核酸絕對定量且具所需試劑少、靈敏度高、成本低等特點，為核酸的檢測提供了一種新的途徑，而一次性生成芯片的量產(chǎn)是實現(xiàn)數(shù)字 PCR技術產(chǎn)業(yè)化應用的核心手段。本文主要描述了一種由 COC材料通過注塑工藝制得的微流控芯片，能單獨完成整個液滴的生成收集、PCR擴增和熒光檢測。與 PDMS芯片微滴生成實驗對比表明，COC芯片生成微滴的速度、直徑大小以及生成微滴的穩(wěn)定性均可滿足實驗的要求。對gDNA的絕對定量實驗結(jié)果表明，該芯片對 DNA的定量具有良好的準確性。由于該芯片通過注塑的工藝加工制作，使獲得的芯片更加統(tǒng)一和標準，批量化的生產(chǎn)模式降低了芯片的成本，為微流控技術和數(shù)字PCR技術的廣泛應用奠定了基礎。

圖10 線性范圍回歸分析Fig.10 Template concentration standard curve