熒光免疫層析定量檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶方法的建立①

王云龍 馬雪虎 李玉林 王繼創(chuàng) 潘維成 閆生輝

(鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州450001)

冠心病(Coronary heart disease，CHD)是嚴(yán)重威脅人體健康和生命的常見(jiàn)病，而動(dòng)脈粥樣硬化又是形成冠心病的重要病理基礎(chǔ)[1]。髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)是在髓系細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)中合成，并且貯存在嗜苯胺藍(lán)顆粒中的一種血紅素輔基蛋白酶[2]。MPO通過(guò)產(chǎn)生自由基和多種反應(yīng)性物質(zhì)[3]，促進(jìn)斑塊形成和不穩(wěn)定性增加，加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，進(jìn)而引起多種并發(fā)癥，如急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)[4]。MPO作為一種心血管疾病炎性生物標(biāo)志物[5]，是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，MPO檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法[6]、免疫比濁法[7]、化學(xué)發(fā)光法[8]等。雖然這些方法靈敏度與準(zhǔn)確度高，但操作過(guò)程繁瑣，需專業(yè)實(shí)驗(yàn)室和操作技術(shù)人員，難以滿足床旁檢測(cè)的需求[9]。本研究擬建立一種熒光免疫層析MPO檢測(cè)的新方法，此法有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)[10]，能夠滿足床旁快檢的要求。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、儀器 羧基熒光微球(Bangs)、硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維棉、吸水紙、PVC板、MPO配對(duì)抗體、羊抗鼠IgG、牛血清白蛋白(BSA)、MPO線性標(biāo)準(zhǔn)品、MPO精密性質(zhì)控品均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，碳二亞胺(EDC)，其他化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?。本研究臨床樣本由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

熒光免疫層析讀數(shù)儀(杭州峰航科技有限公司)、XYZ三維平面點(diǎn)膜噴金儀(上海金標(biāo)生物科技有限公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1試紙條的制備 參照文獻(xiàn)[9]試紙條制備方法。(1)MPO抗體-熒光微球的制備：熒光微球通過(guò)EDC活化，與MPO抗體偶聯(lián)形成復(fù)合物，復(fù)合物再通過(guò)保護(hù)液復(fù)溶、封閉液封閉等過(guò)程，最終制備成MPO抗體-熒光微球以備用。(2)包被與組條：揭去中間粘性貼紙，將NC膜貼入PVC板中部，將稀釋成1.5 mg/ml羊抗鼠IgG、2 mg/ml MPO包被抗體分別作為質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T線)，使用XYZ三維平面點(diǎn)膜噴金儀在NC膜均勻劃線(1 μl/cm)，37℃烘干2 h以備用。揭去上、下端兩條粘性貼紙，將吸水墊、已鋪MPO抗體-熒光微球的結(jié)合墊、樣品墊依次搭接組裝。將組裝好的PVC板放入物料放置平臺(tái)，并切割成寬3.9 mm試紙條，放入鋁箔袋(含干燥劑)中密封4℃保存。

1.2.2檢測(cè) 在試紙條樣品墊中間位置滴加70 μl樣品，5 min后將試紙條放置在熒光免疫層析讀數(shù)儀檢測(cè)，然后在紫外分析儀下觀察。

1.2.3工藝條件優(yōu)化 (1)EDC量的確定：取15 μl 熒光微球加入0.6 ml 0.05 mol/L pH8.0硼酸鹽緩沖液中，旋渦震蕩混勻；依次加入4 mg/ml EDC各10、20、40、60、80 μl，室溫震蕩活化30 min，按1.2.1方法制備5種條件試紙條，用線性標(biāo)準(zhǔn)品分別加樣檢測(cè)。(2)標(biāo)記蛋白量與標(biāo)記時(shí)間的確定在活化后的微球溶液中，依次加入75、100、125、150 μg MPO標(biāo)記抗體，按30、60、90、120 min時(shí)間分別偶聯(lián)。按1.2.1方法制備不同標(biāo)記蛋白量和標(biāo)記時(shí)間試紙條，用100 ng/ml的質(zhì)控品對(duì)不同條件試紙條重復(fù)檢測(cè)3條，結(jié)果取3次平均T線熒光值。(3)最佳保護(hù)液的確定:將偶聯(lián)好的免疫微球復(fù)合物，分別用4種保護(hù)液進(jìn)行復(fù)溶：①0.05 mol/L pH8.0硼酸緩沖液、1%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3；②0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液、1%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3；③0.05 mol/L pH8.0硼酸緩沖液、0.5%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖，0.05%NaN3；④0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液、0.5%T-20、0.2%BSA、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05%NaN3。按1.2.1方法制備4種條件的試紙條，用100 ng/ml的質(zhì)控品重復(fù)檢測(cè)3條，取3次平均T線熒光值并在紫外分析儀下觀察4個(gè)條件熒光現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1EDC量的確定 見(jiàn)表1，在加入EDC 160 μg條件下，線性最好，最佳線性范圍3.125～600 ng/ml，R2=0.980 3。

2.2標(biāo)記蛋白量與標(biāo)記時(shí)間的確定 見(jiàn)表2，隨著蛋白標(biāo)記量的增加，T線熒光值逐漸上升；隨著標(biāo)記時(shí)間增長(zhǎng)，T線熒光值先升后降。標(biāo)記蛋白量125 μg，標(biāo)記1.5 h時(shí)，T線熒光值最高。最佳標(biāo)記蛋白量125 μg，標(biāo)記1.5 h。

表15種EDC量的線性關(guān)系

Tab.1LinearrelationshipbetweenfivekindsofEDCquantities

LinearEDC dosage40 μg80 μg160 μg240 μg320 μgLinear range(ng/ml)6.25-4003.125-5003.125-6006.25-5006.25-500R20.943 20.926 40.980 30.904 50.877 9

表2蛋白標(biāo)記量與標(biāo)記時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果

Tab.2Testingresultsofproteinlabelingandlabelingtime

Proteinlabeling(μg)Labeling time(h)0.511.52757 2387 4828 4448 5321007 4517 5368 4958 4871257 7647 6549 1018 8051507 8328 2348 5788 634

圖1 不同保護(hù)液檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Different protective fluid testing resultsNote: 1.Borate buffer+1%T-20；2.Tris-HCl buffer+1%T-20；3.Borate buffer+0.5%T-20；4.Tris-HCl buffer+0.5%T-20.

圖2 紫外分析結(jié)果Fig.2 UV analysis testing results

2.3最佳保護(hù)液的確定 兩種緩沖液相比，Tris-HCl緩沖液復(fù)溶效果最好，Tris-HCl緩沖液T線熒光值比硼酸緩沖液熒光值高(圖1)；通過(guò)改變T-20的含量，試紙條上聚集現(xiàn)象明顯減少(圖2)。最終確定4號(hào)為最佳保護(hù)液。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度 見(jiàn)圖3，線性范圍在3.125～600 ng/ml，R2=0.984 1。最低檢出限0.9 ng/ml。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve

圖4 熒光層析法和ELISA法的相關(guān)性結(jié)果Fig.4 Linear correlation between two methods testing Fluorescence immunochromatography and ELISA

2.5精密度 通過(guò)M1=12.5 ng/ml、M2=50 ng/ml、M3=200 ng/ml質(zhì)控品檢測(cè)，批內(nèi)變異系數(shù)分別為6.46%、6.09%、5.42%，批間變異系數(shù)分別為9.89%、7.58%、7.37%，均滿足批內(nèi)小于10%，批間小于15%的要求。

2.6方法學(xué)比對(duì) 結(jié)果見(jiàn)圖4，線性回歸方程為：y=1.016 4x+11.825，R2=0.979 5，表明這兩種檢測(cè)方法具有良好的相關(guān)性。

3 討論

繼膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)之后[11]，熒光免疫層析技術(shù)因快捷，既可定性、又可定量，成為床旁快檢技術(shù)(POCT)領(lǐng)域發(fā)展的必然趨勢(shì)[12]。通過(guò)對(duì)本技術(shù)系統(tǒng)研究，確定本研究偶聯(lián)過(guò)程EDC 160 μg，蛋白標(biāo)記量與偶聯(lián)時(shí)間為125 μg、1.5 h。在本研究中，發(fā)現(xiàn)熒光微球聚集影響因素眾多，其關(guān)鍵性問(wèn)題是解決微球聚集。添加表面活性劑，能夠增加親水性，會(huì)影響抗原抗體結(jié)合后的流速。表面活性劑在0.2%～2%的濃度范圍內(nèi)，能夠增強(qiáng)抗原抗體的特異性結(jié)合，更助于樣品釋放，從而提高試紙條靈敏度，也能減少試紙條上微球聚集。本研究通過(guò)借助調(diào)整保護(hù)液中的緩沖體系、表面活性劑，減少試紙條免疫微球聚集，為熒光免疫層析技術(shù)的完善提供一種參考。本方法與國(guó)外ELISA法診斷試劑對(duì)比，相關(guān)性高，為冠心病的臨床診斷提供一種新的手段，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。