礁膜室內(nèi)規(guī)模化人工育苗的研究

粟 文，謝恩義，孫立偉，王艷平，王 惠，徐日升

( 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088 )

礁膜(Monostromanitidium)又名綠紫菜，屬綠藻門(mén)、石莼目、礁膜科、礁膜屬，是冬、春季大型海藻，為一層細(xì)胞組成的膜狀體，黏滑，基部細(xì)胞向下延伸出假根絲組成固著器，成熟時(shí)產(chǎn)生雌、雄配子，配子結(jié)合為合子，并生長(zhǎng)發(fā)育成孢子體。孢子體小型，囊球狀，孢子囊成熟后可產(chǎn)生有4條鞭毛的游孢子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，礁膜營(yíng)養(yǎng)豐富，含有較高的蛋白質(zhì)、碳水化合物及多種維生素和礦質(zhì)元素，口感好，食用價(jià)值高，并具有藥用價(jià)值，有清熱化痰、利水解毒、軟堅(jiān)散結(jié)的作用，常用于治療喉炎、咳嗽痰結(jié)、水腫等[2-4]；從中提取的硫酸多糖有抗凝血、抗氧化、降血脂和抗炎活性[5-6]，因此，礁膜是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的海洋食品、藥物和化妝品等資源。雖然國(guó)內(nèi)對(duì)綠藻的開(kāi)發(fā)利用呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，浙江等地已形成了一定規(guī)模的綠藻加工產(chǎn)業(yè)，但產(chǎn)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外的需求[7-8]。因此開(kāi)展綠藻栽培種——礁膜的人工育苗技術(shù)的研究具有重要意義。

20世紀(jì)90年代，日本Kida[9]較早完成了礁膜的人工育苗與栽培技術(shù)，日本礁膜的產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)比較完善，栽培技術(shù)處于領(lǐng)先水平。隨后，國(guó)內(nèi)陳昌生等[10-12]研究了生態(tài)因子對(duì)礁膜配子和合子的影響；Hua等[13]研究了寬礁膜(M.latissimum)的生活史；謝恩義等[14]對(duì)寬礁膜的基礎(chǔ)生物學(xué)及室內(nèi)育苗與栽培進(jìn)行了較全面的研究；李曉麗等[15]對(duì)北極礁膜(M.arcticum)進(jìn)行了合子采苗、孢子囊培養(yǎng)和孢子采苗等人工育苗試驗(yàn)。這些研究多側(cè)重于基礎(chǔ)研究，雖然有過(guò)人工育苗的嘗試，但均未達(dá)到規(guī)?；绲囊?。要發(fā)展我國(guó)礁膜栽培業(yè)，首先需要建立室內(nèi)人工育苗技術(shù)，筆者對(duì)廣東地區(qū)礁膜進(jìn)行了配子放散、合子附著與培養(yǎng)等相關(guān)試驗(yàn)，旨在建立一套我國(guó)礁膜室內(nèi)人工大規(guī)模育苗技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 種藻來(lái)源

礁膜種藻于2016年3月至4月下旬采自廣東湛江硇洲島附近海域的中高潮帶，藻體加冰低溫運(yùn)輸帶回實(shí)驗(yàn)室，用消毒海水(經(jīng)砂濾及暗沉淀處理的自然海水煮沸消毒20 min，冷卻至常溫)清洗去除藻體表面的泥沙和雜藻。

1.2 成熟礁膜配子日放散規(guī)律

挑選藻體顏色為黃褐色，鏡檢邊緣有一圈成熟配子囊的種藻，吸干藻體表面水分，取1 g種藻放入培養(yǎng)皿中加入20 mL消毒海水(鹽度27)，置于有自然光的恒溫室內(nèi)(24±0.5) ℃，連續(xù)觀察24 h，每隔2 h用移液槍取25 μL配子液移至載玻片上，根據(jù)蓋玻片與視野面積之比，求出蓋玻片下的視野數(shù)(即25 μL配子液的配子數(shù)量)，從而計(jì)算出 20 mL中配子放散量。每次觀察后同時(shí)清洗藻體并更換消毒海水。

1.3 合子附著

黑暗時(shí)間對(duì)合子附著的影響：設(shè)置8個(gè)直徑為6 cm培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿放入3塊2 cm×2 cm×1 mm PVC苗板，倒入相同量配子液，置于黑暗處連續(xù)培養(yǎng)16 h[12-13]，每隔2 h取出1個(gè)培養(yǎng)皿，顯微鏡下(10×10)觀察合子附著數(shù)，根據(jù)苗板面積與視野面積之比，計(jì)算出每塊苗板的合子附著總數(shù)，取均值。

不同附著基對(duì)合子附著的影響：將PVC塑料板、PET塑料板、纖維板、普通玻璃板和有機(jī)玻璃板5種不同材料2 cm×2 cm×1 mm的苗板分別放入5個(gè)直徑為6 cm培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿3塊相同材料苗板，置于黑暗處12 h后同上計(jì)算苗板合子附著總數(shù)。

1.4 合子培養(yǎng)中雜藻硅藻的清除

用內(nèi)徑0.48 cm的鉆孔器取硅藻附著基本一致的苗板圓片，放入200 mL消毒海水中，二氧化鍺質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、20、30、40 mg/L。顯微鏡下(10×10)觀察各圓片附著的硅藻數(shù)，計(jì)算出二氧化鍺對(duì)附著硅藻處理后的脫落率或增長(zhǎng)率。

1.5 礁膜室內(nèi)人工育苗試驗(yàn)

配子放散：將清洗干凈的種藻均勻鋪于干凈通風(fēng)處陰干10～16 h(種藻含水量50%～60%)，稱(chēng)量0.9 kg放入40 L消毒海水中(鹽度27、溫度24 ℃)，充氣攪拌，用光照度為5×104～9×104lx的強(qiáng)光照射，約5 min后加入適量45 ℃蒸餾水[13]，約30 min后用篩絹過(guò)濾出種藻即得配子液。同上計(jì)算配子放散總量。

合子附著與培養(yǎng)：將200張PVC苗板浸入40 L配子液中，黑暗處理12 h，合子附于PVC苗板后(同上計(jì)算合子附著總數(shù))分置于4個(gè)塑料水槽中培養(yǎng)，水容積180 L，每個(gè)月更換消毒海水1～2次。培養(yǎng)期間，每隔5 d測(cè)1次水溫、鹽度、光照和合子直徑，每次測(cè)量20個(gè)合子，取其平均值。

采集游孢子及培育：游孢子采苗使用的附著基為維尼綸繩(海區(qū)栽培多采用苗繩，直徑1 cm)。采游孢子時(shí),將生長(zhǎng)成熟孢子囊的PVC苗板移入消毒海水中，強(qiáng)光照射(5×104～9×104lx)，經(jīng)攪拌待大量游孢子放出，水色變?yōu)闇\綠色時(shí)，取出PVC苗板，放入維尼龍繩，浸泡、翻動(dòng)，待游孢子附著后移至塑料水槽內(nèi)培養(yǎng)，水容積180 L。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，取P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 成熟礁膜配子日放散規(guī)律

3月初即將成熟的礁膜，在室內(nèi)適宜條件下暫養(yǎng)約4 d，藻體邊緣顏色由綠色變成黃褐色，配子囊迅速成熟。鏡檢可見(jiàn)在成熟的配子囊放散配子前，囊壁變成透明狀，極易吸水破裂，配子即從裂口噴射而出。8:00—12:00配子放散量較少，14:00配子放散量較多，18:00—2:00配子放散量基本不變，4:00和6:00出現(xiàn)一個(gè)放散小高峰期，且在4:00時(shí)候配子放散量最高(圖1)。礁膜24 h晝夜均能進(jìn)行配子放散，因此室內(nèi)規(guī)模化人工育苗時(shí)可在較為方便的任何時(shí)間段進(jìn)行采苗。

圖1 礁膜配子的日放散規(guī)律

2.2 合子附著

黑暗時(shí)間對(duì)合子附著的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，黑暗2～16 h均有合子附著，但黑暗時(shí)間短(2～6 h)，合子附著密度低；隨著黑暗時(shí)間的延長(zhǎng)合子附著密度迅速增加，黑暗第8 h，合子的附著數(shù)達(dá)到最高，為8.7×105個(gè)。黑暗時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，合子附著數(shù)逐漸下降，到第14 h時(shí)苗板合子附著數(shù)僅約為第8 h的65%。t檢驗(yàn)表明，黑暗8～12 h間合子附著數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖2 黑暗時(shí)間對(duì)合子附著的影響

不同材料的苗板對(duì)合子附著的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，黑暗處理12 h，合子均能很好地附著于5種材料苗板上，合子附著數(shù)為3.4×105～3.8×105個(gè)。t檢驗(yàn)表明，5種材料苗板之間的合子附著數(shù)不存在顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同材料的苗板對(duì)合子附著的影響

2.3 合子培養(yǎng)中硅藻的清除

二氧化鍺清除硅藻的效果見(jiàn)表1。隨著二氧化鍺質(zhì)量濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，硅藻脫落呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。當(dāng)二氧化鍺質(zhì)量濃度大于0.5 mg/L時(shí)，對(duì)附生硅藻的脫落作用顯著；當(dāng)二氧化鍺質(zhì)量濃度達(dá)3 mg/L時(shí)，苗板圓片上附生的硅藻在第11 d全部脫落。處理后的苗板圓片移至消毒海水繼續(xù)培養(yǎng)20 d，鏡檢合子正常生長(zhǎng)。

2.4 礁膜室內(nèi)人工育苗

配子放散時(shí)可觀察到大量配子聚集在一起成云霧狀，海水變?yōu)闇\綠色，配子放散總數(shù)達(dá)4×1010個(gè)，平均每克藻體放散配子量高達(dá)4.4×108個(gè)。合子的培養(yǎng)條件及生長(zhǎng)見(jiàn)表2。礁膜合子培養(yǎng)時(shí)間自4月中旬至9月中旬，歷時(shí)約5個(gè)月。合子培養(yǎng)前期(4—6月)，水溫較低，生長(zhǎng)較快，合子由5.2 μm增至39 μm，6月下旬，鏡檢合子內(nèi)形成顆粒狀的游孢子，轉(zhuǎn)為孢子囊。7—8月水溫較高，孢子囊生長(zhǎng)緩慢，9月上旬進(jìn)行遮光處理，以促使孢子囊同步成熟。附著于維尼綸繩上的游孢子，培育15 d后可生長(zhǎng)至長(zhǎng)度為1 cm的礁膜幼苗。

表1 二氧化鍺去除硅藻的效果

表2 合子的培養(yǎng)條件及生長(zhǎng)

3 討 論

礁膜室內(nèi)人工育苗技術(shù)能有效解決大面積推廣所需礁膜種藻的問(wèn)題，緩解種質(zhì)退化，為礁膜的規(guī)?；斯び缂霸耘嗵峁┘夹g(shù)支撐。根據(jù)多次采集種藻進(jìn)行配子放散試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在礁膜繁殖盛期3月下旬至4月下旬期間的大潮前后可采集到成熟度較好的種藻，用于生產(chǎn)性育苗。根據(jù)礁膜屬已有的人工育苗研究[13-15]以及試驗(yàn)可知，對(duì)種藻進(jìn)行室內(nèi)陰干刺激處理10～16 h，在采配子過(guò)程中充氣攪拌、強(qiáng)光照射、改變海水溫度(±2～3 ℃為宜)和鹽度(±3～5為宜)能一定程度促使配子集中大量放散。

Kida[9]將附著板打孔穿繩后，采用懸掛式方法進(jìn)行合子附著和培養(yǎng)。本試驗(yàn)采用插槽式方法進(jìn)行合子附著和培養(yǎng)，能極大提高育苗效率，且便于操作管理。規(guī)?；斯び缃ㄗh選用經(jīng)砂輪打磨過(guò)的PVC塑料板作為苗板，便于在5個(gè)月的合子、孢子囊培養(yǎng)期里在顯微鏡下隨時(shí)觀察記錄其生長(zhǎng)情況，苗板不宜過(guò)大，建議規(guī)格為20 cm×10 cm×1 mm。礁膜配子具趨光性，進(jìn)行合子附著黑暗處理能使合子較均勻附著于苗板上，且能增加配子結(jié)合成合子的幾率[16]，但初生合子抗逆性弱，長(zhǎng)久得不到光照，生長(zhǎng)會(huì)受抑制，甚至死亡。本研究采用PVC苗板作為附著基，黑暗8～12 h時(shí)合子附著效率最高，這與陳昌生[11]直接采用培養(yǎng)皿為附著基黑暗10 h合子附著率達(dá)到最大的試驗(yàn)結(jié)果相接近。合子在轉(zhuǎn)為孢子囊前光照度不能長(zhǎng)期低于900 lx，超過(guò)2～3 d合子會(huì)迅速死亡。培養(yǎng)過(guò)程中苗板上極易滋長(zhǎng)藍(lán)藻、綠藻和硅藻等雜藻，雜藻大量生長(zhǎng)，搶占、替代合子生態(tài)位點(diǎn)，或釋放孢子萌發(fā)成小苗而覆蓋合子[13]，進(jìn)而導(dǎo)致合子死亡。用0.5～3 mg/L二氧化鍺處理11 d能有效去除合子培養(yǎng)過(guò)程中滋生的硅藻，藍(lán)藻和綠藻可采用干燥的方法抑制其著生，但無(wú)法徹底根除，且繁殖速度極快。合子、孢子囊的培養(yǎng)期有5個(gè)月，培育效果直接影響到礁膜人工育苗的成敗，因此亟待進(jìn)一步從根本上解決雜藻生長(zhǎng)引起的合子死亡的問(wèn)題。

圖4 礁膜室內(nèi)人工育苗a.種藻室內(nèi)陰干10～16 h；b.種藻放入消毒過(guò)濾海水中，采用充氣攪拌、強(qiáng)光照射等方法促進(jìn)配子放散；c.將種藻濾出后的配子液；d.將PVC苗板浸入配子液中；e.黑暗處理8～12 h，使雌、雄配子結(jié)合成合子附著于PVC苗板上；f.附有合子的PVC苗板；g.附于PVC苗板上的合子(10×10)；h.室內(nèi)合子培養(yǎng)；i.孢子囊釋放游孢子(10×10)；j.培育15 d長(zhǎng)度為1 cm的礁膜幼苗(4×10).