鱟血細(xì)胞蛋白營養(yǎng)學(xué)評價(jià)及其水解肽體外活性

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(1.廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,廣東湛江 524088; 2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

鱟是地球上古老的生物之一,4億多年來保持著最原始的樣貌,是當(dāng)之無愧的活化石[1-2]。鱟的含血量大,成年鱟每年大約可以提供600 mL血。1956年,Bang[3]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠使鱟血細(xì)胞發(fā)生凝集,隨后Levin等[4]從鱟血細(xì)胞里分離純化出能與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的活性成分,人們利用這些活性物質(zhì)制備出鱟試劑,創(chuàng)立了鱟試劑內(nèi)毒素檢測法,運(yùn)用于檢查病人是否被細(xì)菌感染,并在藥品檢驗(yàn)過程中,用來檢測放射性藥物﹑抗生素類﹑疫苗類等制劑純度[5-6]。而提取出內(nèi)容物的血細(xì)胞往往被忽略、被廢棄,成為研究空白。

據(jù)2017年國家統(tǒng)計(jì)局最新數(shù)據(jù),中國已經(jīng)處于老齡化社會,60周歲及以上人口24090萬,占總?cè)丝诘?7.3%。由于老年人各種細(xì)胞器官組織的結(jié)構(gòu)與功能老化,抵抗力下降,發(fā)病率增加,而且一個老年病患者往往同時患多種疾病。隨著生活水平的提高,生活節(jié)奏的加快,我國老年人易患的疾病包括糖尿病[7]和阿爾茲海默病。來源于海洋動物的血細(xì)胞蛋白還具有低抗原性、低過敏性等特性,明顯優(yōu)于陸生動物的血細(xì)胞蛋白[8-9],是制作保健品的理想原料。為了合理開發(fā)利用鱟血細(xì)胞蛋白(TTBCP)這種寶貴資源,滿足人們對肽制品的需求,本文對TTBCP進(jìn)行營養(yǎng)學(xué)評價(jià),測定其體外抗氧化活性和對α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶抑制活性,以期獲得有價(jià)值的研究數(shù)據(jù)證明TTBCP可以用于治療糖尿病和阿爾茲海默病。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱟血細(xì)胞蛋白(TTBCP) 湛江博康海洋生物有限公司;α-葡萄糖苷酶(酶活:300000 U/g)、碘化硫代乙酰膽堿(AICI,純度>98%,批號:C7H16INOS)、5,5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB,純度>99%,批號:C14H8N208S2) 上海金穗生物科技有限公司;乙酰膽堿酯酶(酶活:200 U/g) 上海索萊寶生物科技有限公司;胃蛋白酶(酶活:3800 U/g)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,HPLC 98%)、對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG,純度為99%,批號:K26J8B39810) 上海源葉生物科技有限公司;總抗氧化試劑盒(FRAP法,批號:20170908) 南京建成生物科技有限公司;鄰苯三酚(AR) 上海麥克林生化科技有限公司;鐵氰化鉀(AR) 天津大茂化學(xué)試劑廠;H2O2(AR) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸(AR,純度>99.0%,批號:20151210) 廣東光花科技股份有限公司;Tris-HCl(純度≥99.0%,批號:EZ1609D313) 塞國生物科技責(zé)任有限公司。

DNM-9606酶標(biāo)分析儀 無錫瑞美生物電子科技有限公司;SPH-100B恒溫培養(yǎng)搖床 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-5500紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;TF-FD-1臺式冷凍干燥機(jī) 上海田楓實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TTBCP中氨基酸的測定 按照GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的測定方法,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心完成。

1.2.2 TTBCP的水解方法 TTBCP用胃蛋白酶進(jìn)行水解,在酶解溫度37 ℃﹑酶濃度3%﹑底物濃度4%、pH1.0～2.0條件下,恒溫振蕩水浴3 h后,3000 r/min離心10 min,取上層清液,冷凍干燥后備用[10]。

1.2.3 氨基酸評分(AAS)方法 根據(jù)FAO/WHO 1993年建議的每克氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行營養(yǎng)價(jià)值評定,該模式中,蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和色氨酸分別為:4.0、5.0、3.5、6.0、4.0、7.0、5.5和1.0 g/100 g。氨基酸評分按下式計(jì)算:

氨基酸評分(%)=實(shí)驗(yàn)蛋白氨基酸含量/(FAO/WHO)評分標(biāo)準(zhǔn)模式氨基酸含量×100

1.2.4 蛋白質(zhì)效率比(PER) 根據(jù)Alesmeyer等[10]提出的方程計(jì)算蛋白質(zhì)的效率比,方程如下:

PER1=-0.684+0.456HLeu-0.47HPro

式(1)

PER2=-0.468+0.454HLeu-0.105HTyr

式(2)

PER3=-1.816+0.435HMet+0.780HLeu+0.211HHis-0.944HTyr

式(3)

式中:HLeu為Leu在蛋白中的質(zhì)量百分含量;HPro為Pro在蛋白中的百分含量;HTyr為Tyr在蛋白中的質(zhì)量百分含量;HMet為Met在蛋白中的質(zhì)量百分含量;HHis為His在蛋白中的質(zhì)量百分含量。

式中:A空白對照為PBS液+酶液的吸光度;A樣品組為樣品溶液+酶液的吸光度;A樣品對照組為樣品溶液+PBS液的吸光度。

1.2.6 對乙酰膽堿酯酶的抑制作用 根據(jù)改進(jìn)的Ellman[12]法,依次加入10 μL的0.6 U/mL乙酰膽堿酯酶液,20 μL不同濃度(濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)的TTBCP水解液,10 μL 10.0 mmol/L的DTNB和50 μL 0.01 mol/L pH為7的PBS溶液于96孔板中,在37 ℃恒溫振蕩器中孵化2 min,然后加入10 μL 7.5 mmol/L 的AICI,繼續(xù)在37 ℃的環(huán)境下孵化30 min后測定A415。石杉堿甲作為陽性對照物,其濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。

式中:A空白對照為PBS液+酶液的吸光度;A樣品組為樣品溶液+酶液的吸光度;A樣品對照組為樣品溶液+PBS液的吸光度

1.2.7 總抗氧化能力的測定 20 μL TTBCP水解液(濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)加入180 μL FRAP工作液混勻,37 ℃恒溫振蕩器中孵化10 min后測定A593,根據(jù)反應(yīng)后吸光度,計(jì)算相應(yīng)FRAP值[13]。用維生素C作為陽性對照物,其濃度分別為4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL。

式中:空白對照管以純水代替待測樣品;樣品對照管以無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液。

式中:空白對照管以純水代替待測樣品;樣品對照管以純水代替過氧化氫溶液。

式中:空白對照管以純水代替待測樣品;樣品對照管以純水代替鄰苯三酚溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 TTBCP的氨基酸組成分析

TTBCP的氨基酸組成見表1。從表1可以看出,TTBCP中氨基酸組成全面,其中必需氨基酸模式優(yōu)于成人的FAO/WHO推薦模式,基本符合小孩FAO/WHO推薦模式(只有亮氨酸含量低于模式值)[17]。谷氨酸的含量最高(10.06 g/100 g),賴氨酸含量(5.81 g/100 g)略高于大豆蛋白(5.5 g/100 g)和大米蛋白(4.0 g/100 g)[18],組氨酸的含量(2.97 g/100 g)高于FAO/WHO模式(1.9 g/100 g)和雞蛋模式(2.2 g/100 g)[19]。TTBCP中甲硫氨酸和胱氨酸含量較高,表明鱟血中含有豐富的含硫氨基酸,含硫氨基酸可通過自身的抗氧化作用以及合成有重要抗氧化作用的谷胱甘肽來維持機(jī)體的氧化還原狀態(tài)平衡[20];谷氨酸在人體主要是以谷氨酰胺的形式存在,是細(xì)胞增殖生長必不可少的物質(zhì),能夠?yàn)猷堰屎袜奏さ暮铣商峁┏渥愕牡碵21];賴氨酸促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能,并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用,充足的賴氨酸攝入是幼兒生長發(fā)育的重要保障;組氨酸是幼兒的必需氨基酸,它能促進(jìn)幼兒的免疫系統(tǒng)盡早完善以及強(qiáng)化生理代謝等[19]。通過氨基酸組成分析可以看出,TTBCP是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白。

表1 TTBCP的氨基酸組成Table 1 The amino acid composition of TTBCP

氨基酸根據(jù)化學(xué)成分的不同分為4類，即非極性氨基酸、極性中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸。TTBCP的氨基酸分類見表2,從表2可以看出,非極性氨基酸占TTBCP的24.61%,含量最高,酸性氨基酸次之,芳香族氨基酸含量最低,為7.87%。盡管芳香氨基酸含量最低,但仍略高于其在脫脂小麥胚芽(7.6 g/100 g)[22]中的含量。研究表明,非極性氨基酸和芳香氨基酸對多肽的生物活性有重要影響。當(dāng)非極性氨基酸和芳香族氨基酸出現(xiàn)在多肽的C端時,該多肽具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性[23-24]。因此,TTBCP可以用于制備生物活性肽。

2.2 TTBCP的營養(yǎng)學(xué)評價(jià)

蛋白質(zhì)中的氨基酸含量特別是必需氨基酸含量是蛋白質(zhì)營養(yǎng)學(xué)評價(jià)的重要指標(biāo),WHO/UN(1993)建議,高質(zhì)量的蛋白質(zhì)其必需氨基酸與總氨基酸的比值(E/T)在36%以上,合理的比值有利于氨基酸的利用,促進(jìn)蛋白質(zhì)代謝。從TTBCP的營養(yǎng)評價(jià)表3可以看出,TTBCP的E/T為31.2%,略低于WHO/UN的(E/T)在36%以上理想模式,表明TTBCP中的氨基酸的利用率不太高。

表3 TTBCP的營養(yǎng)學(xué)評價(jià)Table 3 Nutritional evaluation of TTBCP

TTBCP的第一限制性氨基酸是亮氨酸,第二限制性氨基酸是異亮氨酸,第三限制性氨基酸是纈氨酸,除了欠佳的亮氨酸,其他必需氨基酸含量均高于WHO/FAO的小孩建議模式,所以TTBCP主要是限制性必需氨基酸含量的不平衡,就單種必需氨基酸(除了亮氨酸)的含量來說是達(dá)到人體需求量。

PER常作為蛋白質(zhì)吸收利用的評價(jià)指標(biāo),PER越大其吸收利用越高,當(dāng)?shù)鞍椎腜ER大于2.0時,表明該蛋白有較高的營養(yǎng)價(jià)值[10],TTBCP效率比PER1、PER2和PER3小于2.0,進(jìn)一步顯示其中氨基酸的吸收利用率偏低,生物效價(jià)不高。如果補(bǔ)充第一限制性氨基酸亮氨酸含量,平衡TTBCP中各種氨基酸比例,最終將會改善氨基酸利用率,極大提高TTBCP的營養(yǎng)價(jià)值。

2.3 TTBCP水解肽對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

圖1顯示TTBCP水解肽對α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),隨著水解肽濃度的增加抑制率逐漸增強(qiáng),當(dāng)水解肽濃度為0.8 mg/mL時,抑制率最強(qiáng)達(dá)到83.8%,其IC50值為0.199 mg/mL,約為陽性對照阿卡波糖(IC50值為0.024 mg/mL)的十分之一,表明水解肽對α-葡萄糖苷酶有較好的抑制活性,按照α-葡萄糖苷酶的抑制劑的作用機(jī)理,水解肽通過口服經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)叫∧c,通過與多糖等碳水化合物競爭的方式進(jìn)而抑制α-葡萄糖苷酶的活性,延緩和阻礙多糖等碳水化合物的消化分解成葡萄糖,最終減少對葡萄糖的吸收[25],達(dá)到降血糖、治療糖尿病的作用。

圖1 TTBCP水解肽對α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.1 Inhibition ability of TTBCP hydrolysate on α-glucosidase

2.4 TTBCP水解肽對乙酰膽堿酯酶的抑制作用

由圖2可知,在所設(shè)定的水解肽濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,其對乙酰膽堿酯酶的抑制能力也逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)正向量效關(guān)系,表明水解肽能抑制乙酰膽堿酯酶的活性,但是抑制率不超過38%,不到石杉堿甲抑制率的一半,不適合開發(fā)成阿爾茲海默病藥物。

圖2 TTBCP水解肽對乙酰膽堿酯酶的抑制能力Fig.2 Inhibition ability of TTBCP hydrolysate on acetylcholinesterase

2.5 TTBCP水解肽的抗氧化性分析

2.5.1 水解肽的總抗氧化能力分析 水解肽總抗氧化見圖3,由圖3可知,水解肽總抗氧化的FRAP值隨著水解肽質(zhì)量濃度的增大而減少,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于維生素C的FRAP值。

圖3 TTBCP水解肽的總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidative capacity of TTBCP hydrolysate

2.5.2 水解肽對DPPH自由基清除能力的影響 水解肽對DPPH自由基的清除能力如圖4所示,結(jié)果表明,隨著濃度的增加,水解肽對DPPH自由基的清除率增加,呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到最大值(0.80 mg/mL)時,對DPPH自由基的清除能力也到達(dá)最大值,但不到維生素C清除率的一半。

圖4 TTBCP水解肽對DPPH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate against DPPH free radicals

2.5.3 水解肽對羥自由基清除能力影響 水解肽對羥自由基的清除能力如圖5所示,水解肽在0.04～0.12 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),隨著質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng),水解肽濃度在0.12 mg/mL時清除率達(dá)到最大值,接近維生素C的清除率。在0.12～0.20 mg/mL時清除率有所下降,但仍有較高的清除率。

圖5 TTBCP水解肽對羥自由基的清除能力 Fig.5 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate against hydroxyl free radicals

2.5.4 水解肽對超氧陰離子自由基清除能力影響 水解肽對超氧陰離子的清除能力如圖6所示,較低濃度下,水解肽表現(xiàn)出較好的清除能力,而當(dāng)濃度增加時,清除能力并沒有隨著增加。因此,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)清除率變化不大,采用最低濃度便能獲得和最高濃度相當(dāng)?shù)那宄省?/p>

圖6 TTBCP水解肽對超氧陰離子的清除能力Fig.6 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate

2.5.5 水解肽的體外總還原能力分析 水解肽的還原能力如圖7所示。結(jié)果表明在0.4 mg/mL時還原能力最強(qiáng),隨著濃度增加,還原能力沒有變化,可以確定0.4 mg/mL為最佳使用濃度,在低于0.75 mg/mL濃度時還原能力均比維生素C高。

圖7 TTBCP水解肽的還原能力Fig.7 Reducing power of TTBCP hydrolysate

TTBCP水解肽對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.199 mg/mL,抑制率最高達(dá)到83.8%,可以產(chǎn)生降血糖效果;因糖尿病以及糖尿病引起的并發(fā)癥都是跟“氧化應(yīng)激”有著密切的關(guān)系,氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島細(xì)胞受損﹑肝臟胰島素抵抗和外周胰島素抵抗[26],保持體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡至關(guān)重要,特別是中老年糖尿病人容易出現(xiàn)多余的活性氧,有必要食補(bǔ)具有抗氧化活性的物質(zhì);另外,藥物阿卡波糖會延遲葡萄糖在腸道的吸收[27],糖尿病人吃藥過程中需要補(bǔ)充一定的蛋白質(zhì)增強(qiáng)體能,具有清除超氧陰離子自由基﹑DPPH自由基和羥自由基,甚至當(dāng)濃度小于0.75 mg/mL的范圍時,還原能力大于維生素C的TTBCP是不錯的選擇。

3 結(jié)論

TTBCP中必需氨基酸優(yōu)于成人的FAO/WHO推薦模式,AAS為68.1,是有營養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì),由于其中亮氨酸所占比例略低,PER小于2.0,影響到TTBCP吸收利用,在食用TTBCP時要適當(dāng)補(bǔ)充亮氨酸。TTBCP對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.199 mg/mL,抑制率高達(dá)83.8%,有望開發(fā)成降血糖藥物;TTBCP能清除超氧陰離子自由基﹑DPPH自由基和羥自由基,當(dāng)濃度小于0.75 mg/mL的范圍時,還原能力大于維生素C,具有較好的抗氧化活性,能減少氧化應(yīng)激,有助于糖尿病治療。由此可見,TTBCP具有復(fù)合功效,對糖尿病人來說既可提供營養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)蛋白,又可作為保健食品和降血糖藥物。