高效液相色譜測定番茄制品中的三種功能性脂肪酸

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(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,四川成都 610066; 2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院,四川成都 610041)

番茄(LycopersicumesculentumMill.)屬于茄科番茄屬。番茄的果實圓潤光滑、多汁,營養(yǎng)十分豐富,番茄中不僅含可溶性糖、蛋白質(zhì)、膳食纖維和多種礦物質(zhì)元素,還含有番茄紅素、胡蘿卜素、維生素 C 和維生素 A 等多種功能活性物質(zhì)。研究表明,番茄及其制品對“三高”有一定療效和預(yù)防作用,這是因為除了人們熟知的番茄紅素[1-2],還有另外2類鮮為人知的具有降“三高”的活性物質(zhì)γ-氨基丁酸[3]和功能性脂肪酸[4]。日本科學(xué)家首先在番茄制品中發(fā)現(xiàn)了多種功能性脂肪酸[5],包括9-羰基-10(E),12(Z)-十八碳二烯酸(9-oxo-10(E),12(Z)-octadecadienoic acid,9-E,Z-KODE)、9-羰基-10(E),12(E)-十八碳二烯酸(9-oxo-10(E),12(E)-octadecadienoic acid,9-E,E-KODE)、13-羰基-9(Z),11(E)-十八碳二烯酸、13-羰基-9(E),11(E)-十八碳二烯酸、13-羰基-9(Z),11(E),15(Z)-十八碳三烯酸和9-羰基-10(E),12(Z),15(Z)-十八碳三烯酸,這些不飽和脂肪酸衍生物屬于過氧化物酶體增殖物,可激活受體蛋白(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)的產(chǎn)生。PPARs是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,與脂肪細(xì)胞分化有關(guān)[6],并具有促進單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分化的作用[7],其可分為α、β、γ3種類型,其中PPAR-γ作為核轉(zhuǎn)錄受體家族成員,在脂肪細(xì)胞分化、肥胖和糖尿病中具有重要的作用[8]。

9-羥基-十八碳二烯酸(9-hydroxy-octadecadienoic acid,9-HODE)為PPAR-γ天然配體中的一種,屬于氧化低密度脂蛋白脂肪酸衍生物,在動脈粥樣硬化過程中,其對巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控起到關(guān)鍵作用[9]。HODEs 還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放白介素1β[10],白介素1β是促炎細(xì)胞因子,可激活與炎癥、自身免疫疾病等有關(guān)基因的表達(dá)[11-13]。此外,功能性脂肪酸還對人卵巢癌細(xì)胞(HRA)有細(xì)胞毒性作用。研究表明,9-E,E-KODE通過線粒體調(diào)控誘發(fā)HAR癌細(xì)胞的凋亡[14],9-E,E-KODE對培養(yǎng)72 h的人卵巢癌細(xì)胞的抑制活性是9-E,Z-KODE抑制活性的10倍[15]。PPAR-γ的配體廣泛,包括天然和合成的配體。合成的配體藥物有噻唑烷二酮類,包括曲格列酮、羅格列酮等[16]。但是,化學(xué)合成的藥物存在副作用,長期服用會對身體造成一定損害。因此,天然的、有效的來自食品的降脂、降糖產(chǎn)品受到人們的極大關(guān)注。

目前國內(nèi)外對番茄中活性成分的研究多集中在番茄的類胡蘿卜素、酚類化合物以及一些脂肪酸衍生物,但對番茄中9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的研究較少。本研究擬建立高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)法同時測定番茄制品中9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE這三種功能性脂肪酸含量的方法,并用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(High performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)鑒定這三種活性成分;同時應(yīng)用該色譜方法檢測新鮮番茄、市售番茄汁、市售番茄醬和自制番茄醬中這三種活性成分的含量,以期為番茄中功能性脂肪酸的進一步研究提供基礎(chǔ),并對開發(fā)優(yōu)質(zhì)番茄制品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮番茄、番茄醬、番茄汁 購于成都好家鄉(xiāng)超市;自制番茄醬 由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所功能食品研究室研制;9-HODE 純度≥98%,美國Cayman Chemical公司;9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE 純度≥98%,由本課題組從瑪咖中分離得到。

1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;TSQ QUANTUM ULTRA型液相色譜質(zhì)譜儀 美國熱電公司;KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別稱取0.98 mg 9-HODE、4.6 mg 9-E,Z-KODE和7.3 mg 9-E,E-KODE,分別用甲醇溶解,并定容至10 mL作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。采用梯度稀釋法,用甲醇將各標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(見表1),備用。

表1 三種功能性脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度梯度Table 1 The concentrations of three functional fatty acid for standard curves

1.2.2 樣品溶液的制備 自制番茄醬樣品的制備:選取新鮮成熟的番茄,洗凈,破碎,打漿,40 ℃攪拌4 h,過濾(篩孔直徑0.8～0.9 mm),60 ℃減壓濃縮至固形物含量為22%～24%,100 ℃沸水殺菌30 min,冷卻,裝瓶。

新鮮番茄樣品制備:選取新鮮成熟的番茄,洗凈,破碎,打漿。

樣品中9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的提取:番茄樣品(新鮮番茄、市售番茄汁、市售番茄醬、自制番茄醬),冷凍干燥(真空度30 Pa,冷阱溫度-50 ℃,冷凍時間24 h)。稱取1 g干燥樣品粉末于磨砂口錐形瓶中,加入10 mL甲醇,蓋塞,稱重,40 ℃超聲1 h,冷卻,以甲醇補齊重量,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,待測。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);DAD檢測器,檢測波長:234 nm(9-HODE)和280 nm(9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE);柱溫:40 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量20 μL;流動相:0.005%的三氟乙酸水溶液(A)+0.005%的三氟乙酸乙腈溶液(B)。梯度洗脫:0～20 min,55%～78% B;20～25 min,78%～100% B。

1.2.4 HPLC-MS分析條件 此部分試驗送檢至四川大學(xué)分析測試中心完成。色譜條件:流動相A和B分別為0.1%甲酸水溶液和乙腈,流速0.3 mL/min,柱溫:30 ℃,進樣量:0.2 μL。梯度洗脫條件:0～40 min,35%～100% B;40～45 min,100% B。

質(zhì)譜條件:MS采樣速率:1 spectra/s;MS采樣范圍:50～500 m/z;掃描范圍:190～500 m/z;紫外檢測波長234 nm(9-HODE)和280 nm(9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE)。離子源為電噴霧離子源,離子源溫度:325 ℃,檢測方式為多反應(yīng)檢測,鞘氣流速:9.0 L/min,鞘氣溫度:350 ℃,毛細(xì)管電壓:3500 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗的平均值,應(yīng)用Microsoft Excel 97-2003對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS分析

在HPLC-MS分析番茄甲醇提取物成分時,采用的是負(fù)離子檢測方式。根據(jù)總離子流色譜峰上所得到的準(zhǔn)分子離子峰，確定化合物的相對分子質(zhì)量(圖 1),并與對照品的色譜保留時間和紫外吸收特征進行對比,從而鑒定出9-HODE(tmin21.69)、9-E,Z-KODE(tmin23.76)和9-E,E-KODE(tmin24.49)3個化合物,其分子量分別為296.2、294.2和294.2。此前,未見文獻(xiàn)報道過9-HODE存在于番茄或番茄制品中。

圖1 9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的自制番茄醬負(fù)離子模式質(zhì)譜圖Fig.1 MS profiles of 9-HODE,9-E,Z-KODE and 9-E,E-KODE in tomato products注:a:9-HODE;b:9-E,Z-KODE;c:9-E,E-KODE。

2.2 9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的標(biāo)準(zhǔn)品和番茄樣品的HPLC色譜

3種功能性脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品與自制番茄樣品的HPLC色譜圖見圖2。在優(yōu)化好的色譜條件下,9-HODE最大紫外吸收波長在234 nm。9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE是同分異構(gòu)體,最大紫外吸收波長280 nm左右,在此條件下9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE完全分離,分離度均大于1.5,分離效果良好,且目標(biāo)峰形尖銳,對稱性好。因此本方法適合3種功能性脂肪酸的測定。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和番茄樣品的HPLC色譜圖Fig.2 The HPLC chromatograms of standards and samples注:標(biāo)準(zhǔn)品圖譜(A、B),自制番茄醬(C、D),A、C檢測波長234 nm、B、D檢測波長280 nm; 1、2、3分別是9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系 以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,由表2可知,9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度和相應(yīng)峰面積的線性關(guān)系良好。

表2 9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的保留時間和線性關(guān)系Table 2 Retention time and linear relationship of 9-HODE,9-E,Z-KODE and 9-E,E-KODE

2.3.2 精密度試驗 取9-HODE、9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE標(biāo)準(zhǔn)品混合液20 μL，以1.2.3的色譜條件,連續(xù)進樣5次,計算色譜峰面積,結(jié)果顯示,9-HODE、9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為0.11%、0.70%和0.35%,表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 按照1.2.2的方法提取自制番茄醬5份,以1.2.3的色譜條件進行色譜測定分析,測定色譜峰面積,結(jié)果顯示9-HODE、9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE的RSD分別為0.19%、2.13%和0.70%,表明試驗方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取3種混合標(biāo)準(zhǔn)品以1.2.3的色譜條件,分別在時間為0、2、4、6、8 h進樣,計算9-HODE、9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE峰面積,RSD分別為0.34%、0.98%和0.40%,表明試驗穩(wěn)定性良好良好。

2.3.5 加樣回收率實驗 準(zhǔn)確稱取5份自制番茄醬,分別加入一定量的9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE標(biāo)準(zhǔn)品,以1.2.2的方法制備樣品,再按1.2.3的色譜條件進行分析。結(jié)果顯示(表3),9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的平均加標(biāo)回收率分別為99.78%、99.70%和99.39%,RSD分別為2.90%、3.24%和3.38%,表明試驗方法有較好的回收率,回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE回收試驗結(jié)果(n=6)Table 3 Recovery tests for 9-HODE,9-E,Z-KODE and 9-E,E-KODE(n=6)

回收率計算公式:Y(%)=(A-B)/C×100

式中,Y:回收率;A:實測值;B:樣品含量;C:加入標(biāo)準(zhǔn)品含量。

2.4 不同番茄制品中3種功能性脂肪酸的含量結(jié)果及討論

由表4可知,新鮮番茄中均未檢測到9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE,而在自制番茄醬中檢測到三種化合物,這表明這三種化合物的產(chǎn)生可能與加工、儲藏過程中相關(guān)酶的激活有關(guān)。亞油酸經(jīng)脂質(zhì)氧化過程得到HODES,2009年Levandi等[17]發(fā)現(xiàn),小麥貯藏過程中有HODEs形成,Püssa等[18]發(fā)現(xiàn),在畜禽肉在貯藏過程中產(chǎn)生大量亞油酸的氧化產(chǎn)物,其中包括HODEs,某些產(chǎn)品中HODE高達(dá)1000 μg/g,且有研究表明,在各種氧化試驗中9-HODE均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[19]。此外,市售番茄汁、市售番茄醬和自制番茄醬中均檢測到9-HODE,但自制番茄醬中含量遠(yuǎn)高于市售番茄汁和番茄醬中,這可能是加工手段、儲藏時間等造成的差異。

表4 不同番茄制品中9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的含量Table 4 The contents of 9-HODE,9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE in different tomato products

9-E,Z-KODE僅在自制番茄醬中存在,9-E,Z-KODE產(chǎn)生于制造番茄醬的過程中,但其可能不穩(wěn)定,易分解或者轉(zhuǎn)化。Dufour C等[20]研究指出,由脂肪氧化酶催化亞油酸氧化產(chǎn)生的9-E,Z-KODE,再經(jīng)過異構(gòu)化轉(zhuǎn)化為9-E,E-KODE,但在KODE同分異構(gòu)體積累過程中,則以如下順序積累:9-E,E-KODE>13-E,E-KODE>13-Z,E-KODE>9-E,Z-KODE,且在30 h內(nèi),9-E,E-KODE含量隨時間延長逐漸超過9-E,Z-KODE含量。本次試驗中,自制番茄醬中9-E,Z-KODE含量遠(yuǎn)高于9-E,E-KODE,可能是番茄醬自制初期,9-E,Z-KODE還未大量轉(zhuǎn)化成9-E,E-KODE。9-E,E-KODE在新鮮番茄和市售番茄醬中均未檢測到,在市售番茄汁和自制番茄醬中含量較接近。但就9-E,Z-KODE會轉(zhuǎn)化成9-E,E-KODE這一推論,自制番茄醬中9-(E,E)-KODE含量將逐漸增加,并超過市售番茄汁中的含量,這也表明,9-E,E-KODE含量不僅與儲存時間有關(guān),還受到加工手段的影響。

3 結(jié)論

通過高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-MS)鑒定出番茄制品中含有9-羥基-十八碳二烯酸、9-羰基-10(E),12(Z)-十八碳二烯酸、9-羰基-10(E),12(E)-十八碳二烯酸3種功能性脂肪酸,并建立高效液相色譜法檢測這三種化合物的方法,該檢測方法耗時短(20 min),重復(fù)性好(RSD≤2.13%),精密度高(RSD≤0.70%),穩(wěn)定性好(RSD≤0.98%),回收率準(zhǔn)確可靠(RSD≤3.38%)。以此色譜條件檢測4個番茄樣品(新鮮番茄、市售番茄汁、市售番茄醬和自制番茄醬)中三種化合物的含量,結(jié)果表明,新鮮番茄中均未檢測到這三種化合物;9-HODE在市售番茄汁、市售番茄醬和自制番茄醬中含量均較高,其中在自制番茄醬中含量高達(dá)34.84 μg/g,且是首次在番茄制品中發(fā)現(xiàn);9-E,Z-KODE僅在自制番茄醬中檢測到;9-E,E-KODE僅在市售番茄汁和自制番茄醬中檢測到。