木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素的提取工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

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(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 10083)

木鱉果(Momordicacochinchinensis)為葫蘆科苦瓜屬草本植物,原產(chǎn)于東亞和東南亞地區(qū),在中國(guó)主要分布于南部地區(qū)[1],是迄今為止發(fā)現(xiàn)的β-胡蘿卜素含量最高的水果[2]。目前,國(guó)外研究者對(duì)木鱉果中功能成分的種類、含量進(jìn)行了廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)木鱉果果肉中番茄紅素與β-胡蘿卜素含量雖僅有0.380～0.408、0.083～0.769 mg/g[3],但其在假種皮中含量豐富,故被譽(yù)為“來(lái)自天堂的水果”[4-5]。同時(shí)其假種皮中還含有豐富的維生素E以及ω-3-脂肪酸[6],對(duì)于開(kāi)發(fā)木鱉果類新型產(chǎn)品有極其重要的作用。而我國(guó)對(duì)于木鱉果的研究尚處于起步階段,針對(duì)木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素的提取工藝以及性質(zhì)等的研究更是一片空白。人們對(duì)木鱉果的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)不足,僅利用其提取色素制糯米飯或提取木鱉果油[7],其中含量很高的類胡蘿卜素物質(zhì)未被充分利用,且木鱉果中β-胡蘿卜素在食品應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題[8]有待深入研究。

β-胡蘿卜素(C40H56)是一種紅紫至暗紅色、有光澤的斜六面體或結(jié)晶性粉末,有輕微異臭或異味,不溶于水,難溶于甲醇、丙二醇、酸和堿,易溶于二硫化碳、氯仿、乙烷及植物油[9-10],具有高維生素A原活性和強(qiáng)抗氧化特性[11],廣泛應(yīng)用于食品體系中。β-胡蘿卜素作為一種強(qiáng)抗氧化劑,具有高效猝滅單線態(tài)氧和清除自由基的作用。它不但具有防癌抗癌、防輻射抗衰老的特點(diǎn),而且還可以清除香煙和汽車廢氣中的有毒物質(zhì)。由于天然β-胡蘿卜素具有合成品沒(méi)有的特性[12-17],它廣泛應(yīng)用于食品著色、營(yíng)養(yǎng)保健、藥品及飼料四大領(lǐng)域[18-19]。因此,如何高效地從天然植物中提取β-胡蘿卜素有十分重要的研究意義。

本文以木鱉果假種皮為原料,運(yùn)用超聲輔助乙醇提取法,探究其提取β-胡蘿卜素的最佳工藝,并通過(guò)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)對(duì)木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究,為木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素在食品加工中的應(yīng)用以及綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

木鱉果 中國(guó)廣西壯族自治區(qū)南寧市;β-胡蘿卜素 標(biāo)準(zhǔn)品,上海阿拉丁生化科技有限公司;無(wú)水乙醇 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸、磷酸氫二鈉 分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司。

GX-03 150型克多功能粉碎機(jī) 浙江高鑫工貿(mào)有限公司;LQ-A30002型電子天平 瑞安市樂(lè)祺貿(mào)易有限公司;KQ-100DE型超聲破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司;L3660D型低速離心機(jī) 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UV-6100型紫外分光光度儀 上海元析儀器有限公司;GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木鱉果假種皮β-胡蘿卜素的提取工藝 采用敖艷等[20]的方法提取β-胡蘿卜素,方法略作修改。提供工藝流程如下:

木鱉果→去皮取假種皮→40 ℃干燥4 h去核→40 ℃干燥至恒重→粉碎、過(guò)60目篩→超聲輔助提取木鱉果假種皮β-胡蘿卜素→離心過(guò)濾→取上清液即為類胡蘿卜素提取液

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 超聲功率對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響 準(zhǔn)確稱取1 g木鱉果假種皮粉,在超聲時(shí)間為45 min,超聲溫度為55 ℃,料液比為1∶15 g/mL條件下,以不同超聲功率(50、60、70、80、90 W)提取β-胡蘿卜素,測(cè)定并計(jì)算β-胡蘿卜素提取量。

1.2.2.2 超聲溫度對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響 準(zhǔn)確稱取1 g木鱉果假種皮粉,在超聲功率為70 W,超聲時(shí)間為45 min,料液比1∶15 g/mL條件下,以不同超聲溫度(25、35、45、55、65 ℃)提取β-胡蘿卜素,測(cè)定并計(jì)算β-胡蘿卜素提取量。

1.2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響 準(zhǔn)確稱取1 g木鱉果假種皮粉,在超聲功率為70 W,超聲溫度為55 ℃,料液比1∶15 g/mL條件下,以不同超聲時(shí)間(15、30、45、60、75 min)提取β-胡蘿卜素,測(cè)定并計(jì)算β-胡蘿卜素提取量。

1.2.2.4 料液比對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響 準(zhǔn)確稱取1 g木鱉果假種皮粉,在超聲功率為70 W,超聲時(shí)間為45 min,超聲溫度為55 ℃條件下,以不同料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL提取β-胡蘿卜素,測(cè)定并計(jì)算β-胡蘿卜素提取量。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以超聲功率(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)、料液比(D)為考察因素,每個(gè)因素選取3個(gè)對(duì)β-胡蘿卜素提取量影響較大的水平,進(jìn)行L9(34)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以β-胡蘿卜素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)從木鱉果假種皮中提取β-胡蘿卜素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4β-胡蘿卜素含量的測(cè)定β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱量0.0125 gβ-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品,溶于無(wú)水乙醇中,定容至50 mL,制得β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液,用無(wú)水乙醇定容至25 mL,使其濃度分別達(dá)到1、2、3、4、5 μg/mL,于451 nm處測(cè)定吸光值,以吸光值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)β-胡蘿卜素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品所測(cè)吸光值,求得各處理提取液濃度。

根據(jù)翟丹云等[21]的方法測(cè)定木鱉果假種皮中β-胡蘿卜素的含量,方法略作修改。

式(1)

其中:C-β-胡蘿卜素濃度(μg/mL);V-提取液的體積(mL);B-稀釋倍數(shù);M-稱取木鱉果假種皮粉的質(zhì)量(g)。

1.2.5β-胡蘿卜素的純化 實(shí)驗(yàn)中β-胡蘿卜素的浸提劑為乙醇,因此在色素中不可避免混入了一部分醇溶蛋白。為了進(jìn)一步提高β-胡蘿卜素的純度,調(diào)節(jié)pH使其達(dá)到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)并沉淀,離心過(guò)濾除去醇溶蛋白。采用劉緒廣等[22]的方法除去提取液中的醇溶蛋白,方法略作修改。準(zhǔn)確量取木鱉果假種皮色素醇溶液100 mL,用0.05 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH,當(dāng)pH調(diào)至6左右時(shí)溶液產(chǎn)生沉淀。隨后將其放置在-15 ℃的冰箱中,冷凍12 h,肉眼可見(jiàn)溶液中大量絮狀物沉淀,采用離心機(jī)轉(zhuǎn)速4000 r/min離心10 min除去該沉淀,從而得到純度較高的β-胡蘿卜素澄清液。

1.2.6β-胡蘿卜素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 光照對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響 采用敖艷等[20]的方法研究光照對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響,方法略作修改。配制0.05%的木鱉果假種皮色素醇溶液,將其分別置于室外自然光及暗處,每隔24 h測(cè)定溶液的吸光值A(chǔ),根據(jù)公式(2)計(jì)算保留率,研究光照對(duì)木鱉果假種皮色素的影響。

式(2)

其中:A-樣品吸光值;A0-對(duì)照組吸光值。

1.2.6.2 溫度對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響 采用申海進(jìn)等[23]的方法研究溫度對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響,方法略作修改。配制0.05%的木鱉果假種皮色素醇溶液,分別置于4、20、50、75、100 ℃的溫度條件下,每隔1 h測(cè)定溶液的吸光值A(chǔ),根據(jù)公式(2)計(jì)算保留率,研究溫度對(duì)木鱉果假種皮色素的影響。

1.2.6.3 pH對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響 采用申海進(jìn)等[23]的方法研究pH對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響,方法略作修改。配制0.05 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0),使各緩沖液中色素濃度為0.05%,放置4 ℃冰箱中,每隔1 h測(cè)定溶液的吸光值A(chǔ),根據(jù)公式(2)計(jì)算保留率,研究pH對(duì)木鱉果假種皮色素的影響。

1.2.6.4 不同金屬離子對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響 采用申海進(jìn)等[23]的方法研究離子對(duì)β-胡蘿卜素保留率的影響,方法略作修改。配制0.05%的木鱉果假種皮色素醇溶液,分別加入濃度為0.05、1.0 mol/L的Fe3+、Fe2+、Zn2+、Na+、K+、Cu2+溶液,放置4 ℃冰箱中,24 h后測(cè)定吸光值A(chǔ),根據(jù)公式(2)計(jì)算保留率,研究金屬離子對(duì)木鱉果假種皮色素的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理;SPSS Statistics 22.0進(jìn)行極差和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,方程為y=0.097x+0.045,R2=0.9992,擬合度較好,可用于測(cè)定β-胡蘿卜素含量。

圖1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of β-carotene

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲功率對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響 超聲功率對(duì)β-胡蘿卜素的提取量影響如圖2所示。由圖2可知,β-胡蘿卜素提取量隨著超聲功率的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。β-胡蘿卜素提取量在超聲功率為70 W時(shí)最高,達(dá)到1.542 mg/g?？赡艿脑蚴请S著超聲功率的增大,空化作用增強(qiáng),有利于β-胡蘿卜素溶出;而超聲功率在達(dá)到70 W之后色素基本上已經(jīng)溶出,提取量不再上升。因此,選擇超聲功率70 W為適宜功率。

圖2 超聲功率對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on β-carotene extraction

2.2.2 超聲溫度對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響 超聲溫度對(duì)β-胡蘿卜素的提取量影響如圖3所示。當(dāng)溫度在25～55 ℃范圍內(nèi)時(shí),隨著溫度的升高,β-胡蘿卜素提取量增加;當(dāng)提取溫度為55 ℃時(shí),β-胡蘿卜素提取量最高,為1.823 mg/g。而溫度達(dá)到55 ℃以上時(shí),β-胡蘿卜素提取量隨著溫度的升高而急劇降低,可能的原因是β-胡蘿卜素在溫度較高的條件下不穩(wěn)定,易降解[24]。因此,選擇55 ℃為適宜提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響Fig.3 Effect of temperature on β-carotene extraction

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響 超聲時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素的提取量影響如圖4所示。由圖4可以看出,超聲時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響較小,在15～75 min中稍有波動(dòng),超聲時(shí)間為45 min時(shí),β-胡蘿卜素提取量較高,為1.475 mg/g。提取時(shí)間45、60 min時(shí)β-胡蘿卜素提取量變化不大;隨著時(shí)間增加,β-胡蘿卜素提取量下降,推測(cè)原因可能是本實(shí)驗(yàn)在較高溫度下(55 ℃)提取β-胡蘿卜素,而長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)對(duì)β-胡蘿卜素造成破壞,為了保證提取到的β-胡蘿卜素含量更高,應(yīng)選取較短時(shí)間提取β-胡蘿卜素。因此,本實(shí)驗(yàn)選取45 min為適宜提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響Fig.4 Effect of time on β-carotene extraction

2.2.4 料液比對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響 料液比對(duì)β-胡蘿卜素的提取量影響如圖5所示。由圖5可知,料液比從1∶5～1∶25 g/mL之間,β-胡蘿卜素的提取量隨著料液比的增大呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶15 g/mL時(shí),假種皮中β-胡蘿卜素的提取量最高,達(dá)到1.423 mg/g。可能的原因是隨著料液比的增大,β-胡蘿卜素的提取量升高,當(dāng)料液比大于1∶15 g/mL時(shí),溶出的脂溶性雜質(zhì)成分可與乙醇結(jié)合,導(dǎo)致β-胡蘿卜素提取量不再上升。所以確定假種皮β-胡蘿卜素的適宜提取料液比為1∶15 g/mL。

圖5 料液比對(duì)β-胡蘿卜素提取量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on β-carotene extraction

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2的極差分析結(jié)果可以看出,RC>RD>RA>RB,因此4個(gè)因素對(duì)超聲波輔助乙醇提取β-胡蘿卜素的效果影響的大小順序?yàn)?超聲溫度(C)>料液比(D)>超聲功率(A)>超聲時(shí)間(B)。其中,超聲溫度F值>F0.01,對(duì)提取量影響極顯著,料液比F值>F0.05,對(duì)提取量影響顯著;超聲功率以及超聲時(shí)間對(duì)提取量影響不大。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi),優(yōu)化得到超聲波輔助乙醇提取β-胡蘿卜素的最佳條件為A1B3C3D3,即超聲功率60 W、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度65 ℃、料液比1∶20 g/mL。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 L9(34)orthogonal array design and results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance results of orthogonal test analysis

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

以2.3中正交試驗(yàn)得出的最佳條件為基礎(chǔ)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),通過(guò)計(jì)算得到的β-胡蘿卜素提取量約為(2.212±0.075) mg/g,高于正交表中試驗(yàn)結(jié)果,說(shuō)明采用正交法得到的優(yōu)化工藝可行性強(qiáng),優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 光照對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響 光照對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響如圖6所示。由圖6可知,在避光條件下β-胡蘿卜素保留率在100%左右波動(dòng),穩(wěn)定性較好。但是在光照條件下,隨著時(shí)間的增加β-胡蘿卜素不斷降解,保留率顯著下降,在第5 d時(shí)保留率僅為15.28%。這說(shuō)明β-胡蘿卜素在強(qiáng)烈日光照射下極不穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)比可知,光照會(huì)使β-胡蘿卜素的降解速率增加。總體來(lái)看,避光條件下有利于β-胡蘿卜素的保存。

圖6 光照對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of light on stability of β-carotene

2.5.2 溫度對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響 溫度對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響如圖7所示。圖7中結(jié)果顯示,在4、25 ℃條件下,β-胡蘿卜素的保留率在100%上下波動(dòng),波動(dòng)較小;在50 ℃條件下,β-胡蘿卜素的保留率稍有增加,這可能是在加熱過(guò)程中溶出了其他顯色色素;而在100 ℃下,β-胡蘿卜素保留率明顯降低,在第6 h保留率為71.37%?？傮w來(lái)看,β-胡蘿卜素不耐高溫,對(duì)低溫及室溫有較強(qiáng)的耐受性。因此低溫或室溫條件是保存β-胡蘿卜素的有利條件。

圖7 溫度對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of temperature on stability of β-carotene

2.5.3 pH對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響 pH對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響如圖8所示。由圖8可知,在酸性條件下(pH為3.0、4.0、5.0、6.0),β-胡蘿卜素的保留率較高,隨著時(shí)間的增加趨于穩(wěn)定,約為110.00%;在堿性和中性條件下,保留率明顯下降,反應(yīng)2 h后達(dá)到60.00%左右并保持穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中觀察到在堿性環(huán)境(pH為8.0)時(shí)溶液中迅速產(chǎn)生大量黃色絮狀沉淀,這說(shuō)明β-胡蘿卜素在堿性條件下沉降,而在測(cè)定吸光度時(shí)主要顯色物質(zhì)是β-胡蘿卜素,因此吸光度減小。

圖8 pH對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of pH on stability of β-carotene

2.5.4 不同金屬離子對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響 離子對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響如表4所示。由表4可知,Na+、K+對(duì)木鱉果假種皮β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性影響不大,12 h內(nèi)β-胡蘿卜素的保留率均約等于100%,溶液顏色穩(wěn)定呈淺黃色、稍有渾濁,而其余離子對(duì)假種皮β-胡蘿卜素穩(wěn)定性均有一定的影響。加入Fe3+后,β-胡蘿卜素的保留率明顯增加,提取液顏色呈黃偏褐色,這可能是因?yàn)镕e3+本身的顏色使得溶液黃色更深,表現(xiàn)為吸光值明顯增大。而在Fe2+、Cu2+溶液環(huán)境中,保留率降低,且隨著濃度的增加,保留率更小。在Zn2+存在條件下,保留率急劇降低,在0.1 mol/L時(shí)降低至29.96%,在提取液顏色變淺的同時(shí)迅速形成大量沉淀,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似[24]。

表4 金屬離子對(duì)β-胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of metal ions on stability of β-carotene

3 結(jié)論

采用超聲波輔助乙醇提取木鱉果假種皮中的β-胡蘿卜素時(shí),最佳提取條件為超聲功率60 W、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度65 ℃、料液比1∶20 g/mL,此條件下的提取量為(2.212±0.075) mg/g。

在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究中得出β-胡蘿卜素對(duì)光照、溫度、酸堿環(huán)境、離子較為敏感。β-胡蘿卜素受光照、高溫影響較大,在光照和100 ℃下降解較快,因此避光、低溫或室溫是保存β-胡蘿卜素的有利條件。酸性條件對(duì)β-胡蘿卜素有增色作用,保留率升高;而在堿性條件下,β-胡蘿卜素發(fā)生沉降,保留率降低,因此要避免在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下保存β-胡蘿卜素。Fe3+對(duì)β-胡蘿卜素有增色作用,而Fe2+、Zn2+、Cu2+對(duì)其有不同程度的減色作用,尤其在Zn2+存在條件下,β-胡蘿卜素特別不穩(wěn)定,產(chǎn)生大量絮狀沉淀,溶液淺黃接近無(wú)色,而在Na+、K+環(huán)境下則有利于其儲(chǔ)存。