響應(yīng)面法優(yōu)化熱回流提取樟樹葉中木脂素工藝

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(1.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖南長沙 410004; 2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410004)

樟樹(Cinnamomumcamphora)是樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠性喬木,屬藥用植物,廣泛分布于我國長江以南、西南各省以及臺(tái)灣南部。樟樹根莖發(fā)達(dá)、生長快,材質(zhì)優(yōu)良,具有“江南寶樹”之稱[1]。目前的研究表明,樟樹含有的化學(xué)成分主要包括揮發(fā)性油[2]、蛋白核糖體[3]、黃酮類[4]、木脂素[5]、有機(jī)酸和甾醇等[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)樟樹的根、莖、葉、果實(shí)、籽均具有一定的生物活性,主要表現(xiàn)在抑菌、防腐保鮮、驅(qū)蟲、抗氧化、消炎、細(xì)胞毒活性等方面[7]。

木脂素作為存在于植物中的一類由兩分子苯丙素衍生物聚合而成的天然化合物,廣泛分布于植物的根、莖、葉、花、種子等部位,多數(shù)呈游離狀態(tài),少數(shù)與糖結(jié)合成苷[8]。具有多種生物活性,如保護(hù)肝臟、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌等功效[9-10]。木脂素除了與多糖類物質(zhì)形成極性較強(qiáng)的糖苷外,還易與植物體內(nèi)其他物質(zhì)結(jié)合,如多酚、黃酮類化合物以及葉綠素,使得木脂素很難與其他物質(zhì)分離開來,從而增加了木脂素的提取難度[11]。另外,由于木脂素具有難溶于水,能溶于氯仿、乙酸乙酯、乙醚、乙醇和丙酮等親脂性有機(jī)溶劑的理化特性,因此,對(duì)木脂素進(jìn)行提取時(shí)，需要考慮合適的溶劑及提取方法。近年來,有關(guān)木脂素提取方法主要有熱回流提取[12]、微波提取[13]、閃式提取[14]、離子液體超聲提取[15]、超臨界CO2提取等[16]。微波提取、離子液體超聲提取以及超臨界CO2提取等現(xiàn)代提取手段，雖然節(jié)省時(shí)間,但是裝置復(fù)雜、設(shè)備昂貴。而熱回流提取作為傳統(tǒng)提取方法,雖然提取時(shí)間較長,但是操作簡單、節(jié)約成本、低耗環(huán)保,尤其在藥材中有效成分提取方面被廣泛應(yīng)用。此外,該方法可以減少木脂素類物質(zhì)在提取過程中的損失。

目前,國內(nèi)外對(duì)樟樹葉中木脂素提取研究報(bào)道較少,因此,本研究采用熱回流法考察乙醇濃度、料液比、回流次數(shù)、回流時(shí)間以及提取溫度對(duì)樟樹葉中木脂素提取量的影響,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化最佳工藝條件,為樟樹資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟樹葉(Cinnamomumcamphora(L.)Presl) 小葉樟,2016年5月摘自中南林業(yè)科技大學(xué)校區(qū);五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)樣品 色譜純(純度≥98%),上海源葉生物技術(shù)有限公司;變色酸 分析純,天津市新精細(xì)化工開發(fā)中心;濃硫酸 分析純,國藥集團(tuán);無水乙醇 分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

JE602型精密電子天平 上海浦春計(jì)量儀器有限公司;Hei-VAP Precision型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國Heidolph公司;HWS26型恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV-1800型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;DZF-6050型真空干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樟樹葉中木脂素提取的工藝流程 樟樹葉清洗、晾干→105 ℃烘箱內(nèi)殺青30 min、再將烘箱調(diào)成至70 ℃至樟樹葉烘干→粉碎過60目篩→乙醇熱回流提取3次→真空抽濾合并濾液→濃縮→干燥(60 ℃，0.06 MPa真空干燥箱烘干至恒重)→乙醇溶解得木脂素待測(cè)液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取樟樹葉粉5.0 g,置于圓底燒瓶內(nèi),考察乙醇濃度、料液比、回流時(shí)間、回流次數(shù)、提取溫度對(duì)木脂素提取量的影響。

1.2.2.1 乙醇濃度對(duì)木脂素提取量影響 以料液比1∶16 g/mL、回流3 h、提取3次、60 ℃提取溫度為固定條件,考察濃度為55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液對(duì)木脂素提取量的影響。

1.2.2.2 料液比對(duì)木脂素提取量影響 以85%乙醇、回流3 h、提取3次、60 ℃提取溫度為固定條件,考察不同料液比1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20 g/mL對(duì)木脂素提取量的影響。

1.2.2.3 回流時(shí)間對(duì)木脂素提取量影響 以85%乙醇、料液比1∶12 g/mL、提取3次、60 ℃提取溫度為固定條件,考察回流提取1、2、3、4、5 h后對(duì)木脂素提取量的影響。

1.2.2.4 回流次數(shù)對(duì)木脂素提取量影響 以85%乙醇濃度、料液比1∶12 g/mL、回流3 h、60 ℃提取溫度為固定條件,考察回流提取1、2、3、4次后對(duì)木脂素提取量影響。

1.2.2.5 提取溫度對(duì)木脂素提取量影響 以85%乙醇濃度、料液比1∶12 g/mL、回流3次、回流3 h為固定條件,考察提取溫度為50、60、70、80、90 ℃對(duì)木脂素提取量影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇對(duì)木脂素提取量影響較大的4個(gè)因素,即乙醇濃度、回流次數(shù)、提取溫度以及料液比進(jìn)一步考察。確定試驗(yàn)因素及水平之后，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以乙醇濃度、回流次數(shù)、提取溫度、料液比為影響因子,樟樹葉中木脂素提取量為響應(yīng)值,研究響應(yīng)面法優(yōu)化樟樹葉中木脂素?zé)峄亓魈崛」に嘯18],各因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 紫外可見分光光度法測(cè)定木脂素含量 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:參考文獻(xiàn)[17]并做修改,準(zhǔn)確稱取五味子酯甲對(duì)照品4.0 mg,用無水乙醇溶解并定容至10 mL,配制成0.4 mg/mL的儲(chǔ)備液,分別吸取此溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL儲(chǔ)備液于5 mL刻度試管中,水浴揮干乙醇,分別精密地加入10%變色酸水溶液0.5 mL、濃硫酸3 mL、蒸餾水1.5 mL,搖勻后在沸水浴中加熱30 min,迅速冷卻,用蒸餾水準(zhǔn)確定容5 mL,使五味子酯甲的最終濃度為0、0.016、0.032、0.048、0.064、0.08、0.096 mg/mL,在570 nm處檢測(cè)其吸光度,測(cè)定3次,以五味子酯甲的濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得濃度(mg/mL)與吸光度(A)的關(guān)系曲線,回歸方程為:y=11.3275x+0.02277,相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。

木脂素提取量按式(1)計(jì)算:

式(1)

式中:p-木脂素提取量,mg/g;c-樣品中木脂素濃度,mg/mL;v-樣品體積,mL;m-樟樹葉質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù),采用origin 8.0對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行作圖,響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 由圖1可以看出,當(dāng)乙醇濃度在55%～85%,隨著乙醇濃度的增加,木脂素的提取量逐漸增加;而當(dāng)濃度大于85%時(shí),木脂素提取量逐漸減少,原因可能是水的極性較強(qiáng),提取溶劑中水的含量影響該體系的極性,當(dāng)溶劑乙醇濃度越高時(shí)水的含量會(huì)越低,溶劑的極性減弱,而木脂素屬于弱極性分子,根據(jù)相似相溶原理,極性相近的有機(jī)物與有機(jī)溶劑更容易互溶,所以乙醇濃度在55%～85%范圍內(nèi),木脂素提取量會(huì)隨乙醇濃度增加而升高。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到85%時(shí),此時(shí)溶劑極性與木脂素的極性最接近,木脂素提取量最高。但是當(dāng)繼續(xù)增加乙醇濃度時(shí)，木脂素提取量下降，有可能是溶劑的極性發(fā)生改變，不利于木脂素分子提取,另外,也有可能樟葉中其他物質(zhì)的溶出阻礙了木脂素分子的溶出[19]。因此,選擇乙醇濃度85%左右較合理。

圖1 乙醇濃度對(duì)木脂素提取量影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction content of lignans

2.1.2 料液比對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 由圖2可知,隨著料液比增加,樟樹葉中木脂素提取量逐漸升高,當(dāng)料液比為1∶12 g/mL時(shí),木脂素提取量達(dá)到最大，繼續(xù)增加料液比，提取量增加趨勢(shì)不明顯,基本穩(wěn)定不變。一般來說,提取溶劑用量越大,分子溶出量越多。但當(dāng)提取溶劑用量增加到一定程度,該溶劑已將木脂素分子基本溶出,故木脂素提取量趨于穩(wěn)定?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中需要節(jié)約資源降低成本,因此,選擇料液比為1∶12 g/mL左右進(jìn)行提取樟葉中木脂素。

圖2 料液比對(duì)木脂素提取量影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction content of lignans

2.1.3 回流時(shí)間對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 由圖3可知,回流提取3 h,木脂素提取量最高為35.67 mg/g,回流時(shí)間小于3 h,木脂素提取量隨時(shí)間增加呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì),回流時(shí)間大于3 h,木脂素提取量隨回流時(shí)間增加略有下降。一般來說,回流時(shí)間越長越利于木脂素的提取。但是,回流時(shí)間太長,木脂素提取量下降,可能是因?yàn)榛亓鲿r(shí)間太久，使得木脂素分子結(jié)構(gòu)受到溫度影響發(fā)生變化，從而導(dǎo)致木脂素得率降低。因此,回流時(shí)間太久不利于木脂素的提取,故選擇回流時(shí)間為3 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)木脂素提取量影響Fig.3 Effect of time on extraction content of lignans

2.1.4 回流次數(shù)對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 由圖4可知,隨回流次數(shù)增加,木脂素提取量逐漸上升,當(dāng)回流次數(shù)大于3次時(shí),木脂素提取量略有上升,但基本趨于穩(wěn)定。一般情況下,木脂素提取量隨提取次數(shù)增加而上升,但是當(dāng)提取超過一定次數(shù)時(shí),木脂素浸出將達(dá)到平衡階段,木脂素提取量基本穩(wěn)定不變。因此,選擇提取2～4次之間較合適。

圖4 提取次數(shù)對(duì)木脂素提取量影響Fig.4 Effect of times on extraction content of lignans

2.1.5 溫度對(duì)樟葉木脂素提取量的影響 由圖5可知,溫度小于70 ℃時(shí),隨提取溫度升高,木脂素提取量不斷增加,溫度達(dá)到70 ℃ 時(shí),木脂素提取量達(dá)到最高值即42.95 mg/g。但是,當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí),木脂素提取量呈下降趨勢(shì)。原因是溫度升高可加快分子運(yùn)動(dòng)速度,同時(shí),高溫可以引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致其滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快。因此,隨提取溫度的升高樟樹葉中木脂素類化合物的含量升高;但是,由于乙醇的沸點(diǎn)為78.3 ℃,溫度過高可能引起乙醇揮發(fā),水的含量相對(duì)增加,溶劑的極性也會(huì)增加,不利于木脂素的提取,高溫也會(huì)引起木脂素類化合物結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致其提取量降低。因此,選擇65～75 ℃最為合適。

圖5 提取溫度對(duì)木脂素提取量影響Fig.5 Effect of temperature on extraction content of lignans

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken Design的中心組合設(shè)計(jì)原理,綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法,響應(yīng)面優(yōu)化分析方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Experimengtal design and responses values for response surface analysis

利用軟件Design Expert 8.0,以樟樹葉木脂素提取量為響應(yīng)值進(jìn)行分析,經(jīng)回歸擬合后得出,各影響因子對(duì)響應(yīng)值影響的多元二次響應(yīng)面回歸模型用方程(2)表示,回歸分析見表3。

Y=44.27+1.53A-1.18B-0.13C-1.59D+1.29AB-0.43AC-2.96AD+1.07BC-0.62BD-2.31CD-3.09A2-4.37B2-4.68C2-3.14D2

式(2)

2.2.2 各因素交互作用響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)值與各因素構(gòu)成的三維空間，在二維平面上的等高圖可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線圖趨于橢圓形,表明交互作用明顯;趨于圓形,表面交互作用較弱[22]。此外,若響應(yīng)面的坡度較陡峭,表明響應(yīng)值受操作條件的變化而影響較大[23]。

由圖6a～圖6f可以看出,乙醇濃度與回流次數(shù)、料液比與乙醇濃度、提取溫度與回流次數(shù)以及料液比與提取溫度之間交互作用的等高線均呈扁平狀,表明上述因素的交互作用均對(duì)木脂素提取量有顯著或極顯著影響(p<0.05或p<0.01),其他因素之間交互作用對(duì)木脂素提取量無顯著性影響。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出,在所選的范圍內(nèi)存在最大值即等高線最小橢圓的中心點(diǎn)為響應(yīng)面的極值,也就是響應(yīng)值的最大值[23]。

圖6 提取條件對(duì)樟樹葉中木脂素提取量交互影響的曲面圖及等高線Fig.6 Surface and contour plots mutual influence for the extraction conditions on the yield of lignans from Cinnamomum camphora

2.2.3 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證 通過Design Expert 8.0軟件,結(jié)合回歸模型與響應(yīng)面圖分析得出,樟樹葉粉為5.0 g時(shí),回流提取樟樹葉中木脂素最優(yōu)工藝條件:乙醇濃度87.42%、回流3次、提取溫度70.45 ℃、料液比1∶10.98 g/mL,此條件下木脂素提取量預(yù)測(cè)值為44.27 mg/g。考慮到實(shí)驗(yàn)操作的方便性,將響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)工藝條件調(diào)整為:乙醇濃度87%、回流3次、提取溫度70 ℃、料液比1∶11 g/mL,此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)后,木脂素平均提取量為(43.39±4.91) mg/g,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差較小,表明預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值具有良好的一致性,進(jìn)一步說明該回歸模型的準(zhǔn)確性和可靠性,具有一定應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn),以乙醇濃度、料液比、回流次數(shù)及提取溫度為影響因子,樟樹葉中木脂素提取量為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化樟樹葉中木脂素的熱回流提取工藝,得出最佳提取工藝條件為:乙醇濃度87%,料液比1∶11 g/mL,回流3次,提取溫度70 ℃,此條件下木脂素的提取量為(43.39±4.91) mg/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值存在較好的一致性,此回歸模型對(duì)于優(yōu)化樟樹葉中木脂素的熱回流法提取工藝是合理的。