基于Red重組系統(tǒng)的陰溝腸桿菌基因重組技術(shù)

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(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444; 2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，生物煉制實(shí)驗(yàn)室,上海 201210; 3.廣東本科檢測(cè)有限公司,廣東汕頭 515071)

Red重組系統(tǒng)是大腸桿菌(Escherichiacoli)中最常用的基因重組系統(tǒng),該系統(tǒng)從λ噬菌體衍化而來(lái),主要由Exo、Bet、Gam三個(gè)基因組成。Exo基因編碼一個(gè)5′-3′核酸外切酶,該酶可以作用于雙鏈DNA,產(chǎn)生3′端突出。Bet基因編碼一種單鏈DNA結(jié)合蛋白,該蛋白具有介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA退火的功能,防止單鏈DNA被核酸酶降解[1]。Gam基因編碼的蛋白能夠與宿主菌的RecBCD核酸外切酶結(jié)合,抑制其對(duì)外源DNA的降解。由于該系統(tǒng)可以利用具有36堿基同源臂的抗性盒進(jìn)行基因重組,使得同源臂可以直接合成在引物上,而不需要將目的基因克隆出,使得整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)單、高效[2]。目前,已經(jīng)有學(xué)者將Red重組系統(tǒng)改造修飾后用于多種細(xì)菌及真菌的基因替換,例如:痢疾桿菌(Bacillusdysenteriae)[3]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[4]、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)[5]、霍亂弧菌(Vibriocholerae)[6]、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)[7]及耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)[8]等。

陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)是一種重要的工業(yè)微生物,在自然界中廣泛存在,屬于革蘭氏陰性菌,其生長(zhǎng)力旺盛,耐受能力強(qiáng),培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、底物廣泛且底物利用率高。有學(xué)者報(bào)道利用該菌作為底盤生物發(fā)酵葡萄糖可以合成乙偶姻[10]、2,3-丁二醇[11]、雙乙酰[12]和乙醇[13]等化學(xué)品;在環(huán)境保護(hù)方面,E.cloacae也可以用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥[14]。陰溝腸桿菌(E.cloacae)[11]、克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)[15]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[16]等多種微生物可以合成2,3-丁二醇。這些微生物中2,3-丁二醇的合成途徑都相同。丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的催化下形成乙酰乳酸,乙酰乳酸在脫羧酶的催化下形成乙偶姻,乙偶姻在丁二醇還原酶的催化下形成2,3-丁二醇,這三個(gè)酶的編碼基因分別為budB(AlsS)、budA和budC[17]。在課題組前期的研究中,K.pneumoniae的乙酰乳酸脫羧酶(budA)失活后菌株合成乙偶姻和2,3-丁二醇的能力喪失,但是該突變株在低pH高溶氧條件下可以合成高水平的2-酮基葡萄糖酸[18],在中性pH、低溶氧條件下可以合成α-酮異戊酸[19]。現(xiàn)有的報(bào)道中,E.cloacae中最常用的基因重組方法是自殺型質(zhì)粒法[11]。該方法周期較長(zhǎng),敲除效率低,且抗性標(biāo)記不易消除。為了建立一種適用于E.cloacae的基因重組方法,本文將Red重組系統(tǒng)引入E.cloacae中,并對(duì)抗性盒同源臂長(zhǎng)度進(jìn)行了優(yōu)化。進(jìn)一步的研究中,研究了利用Flp重組酶系統(tǒng)消除突變株的抗性標(biāo)記基因。

利用Red重組系統(tǒng)對(duì)E.coli進(jìn)行基因缺失時(shí),常用的質(zhì)粒為pKD46,其上帶有Red重組酶基因,而在消除抗性標(biāo)記時(shí)常用的質(zhì)粒為PCP20,其上帶有Flp重組酶基因,兩種質(zhì)粒所帶抗性基因均為氨芐青霉素[9]。本文所使用的E.cloacae是從自然界篩選得到,天然帶有氨芐青霉素抗性,不能直接將兩種質(zhì)粒用于E.cloacae的基因重組,因此選用pSC-MSC質(zhì)粒作為Red和Flp重組酶的表達(dá)載體,該質(zhì)粒的啟動(dòng)子為溫控型啟動(dòng)子,在基因敲除時(shí)可以較方便的誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR清潔試劑盒 Axygen公司;DNA Maker(10kb)、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(BamH I、Nco I及Dpn I) Thermofisher公司;kod-plus-Neo DNA聚合酶 TOYOBO公司;Taq DNA聚合酶 康為世紀(jì)公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)于國(guó)藥;發(fā)酵種子用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),配方為氯化鈉10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L。發(fā)酵用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,組成成分為:葡萄糖50 g/L,酵母提取物15 g/L,玉米漿粉12 g/L,硫酸銨15 g/L,氯化鉀1.2 g/L,醋酸鈉9 g/L,七水合硫酸鎂0.3 g/L,七水合硫酸亞鐵0.06 g/L,一水合硫酸錳0.03 g/L;實(shí)驗(yàn)所用菌株及來(lái)源見(jiàn)表1,實(shí)驗(yàn)所用引物及序列見(jiàn)表2。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

表2 PCR所用引物及其序列Table 2 Oligonucleotides used for PCR

ZHJH-C1115C型超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司;S1000 Thermal Cycler PCR儀、MicroPulser電轉(zhuǎn)儀、1 mm電轉(zhuǎn)杯、PowerPac Basic電泳儀、Gel Dox XR+凝膠成像儀 BIO-RAD;WFJ 2100型可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;ZWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;RID-10A/SPD-20A高效液相色譜 SHIMADZU;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器 SANYO;Biostat A Plus發(fā)酵罐 Sartorius。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pSC-MSC-red及pSC-MSC-flp的構(gòu)建 以質(zhì)粒pSC-MSC-red的構(gòu)建為例,利用表2中的引物red-s及red-a以pIJ790質(zhì)粒為模板擴(kuò)增red基因,通過(guò)TA克隆將red基因連接到pMD18-T載體上,獲得質(zhì)粒pMD18-T-red。利用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Nco I分別同時(shí)處理pMD18-T-red質(zhì)粒和pSC-MSC質(zhì)粒,割膠回收獲得帶有粘性末端的red基因片段及線性載體pSC-MSC。在T4 DNA連接酶的作用下,載體與片段發(fā)生連接獲得重組質(zhì)粒pSC-MSC-red,化轉(zhuǎn)到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增后提取該質(zhì)粒,PCR驗(yàn)證并測(cè)序。

構(gòu)建pSC-MSC-flp質(zhì)粒時(shí),擴(kuò)增flp基因用表2中的引物flp-a和flp-s,模板為pDK6-flp,其余步驟與pSC-MSC-red質(zhì)粒的構(gòu)建相同。

1.2.2 帶長(zhǎng)同源臂抗性盒的構(gòu)建 以E.cloacae的基因組為模板,利用表2中的引物budAk-s及budAk-a擴(kuò)增目的基因budA-Ec,所擴(kuò)基因包含budA原始基因及其上下游500 bp外圍基因。將目的基因budA-Ec連接到pMD18-T載體上獲得質(zhì)粒pMD18-T-budA-Ec。制作E.coliDH5α/PIJ790的感受態(tài)細(xì)胞,將菌株劃線于LB固體平板,待長(zhǎng)出單克隆后挑取單克隆接種于LB液體試管,過(guò)夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至50 mL液體LB培養(yǎng)基中,當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600=0.5時(shí),冰域放置30 min;4 ℃,5000 r/min離心10 min收集感受態(tài)細(xì)胞,用預(yù)冷的無(wú)菌水清洗感受態(tài)細(xì)胞3次,調(diào)整細(xì)胞終濃度為OD600=10獲得E.coliDH5α/PIJ790的感受態(tài)細(xì)胞。設(shè)置電轉(zhuǎn)儀2.0 kV,200 Ω,25 μF將pMD18-T-budA-Ec質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α/PIJ790,獲得含有雙質(zhì)粒的菌株命名為E.coliDH5α/PIJ790/pMD18-T-budA-Ec。以PIJ773質(zhì)粒為模板,利用表2中的引物FRT-s1及FRT-a1擴(kuò)增出帶有39 bp同源臂的抗性盒。

制作菌株E.coliDH5α/PIJ790/pMD18-T-budA-Ec的感受態(tài)(培養(yǎng)初期時(shí)加入10 mmol/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)pIJ790質(zhì)粒上的Red重組酶表達(dá)),將含有39 bp同源臂的抗性盒電擊轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中,在Red重組酶的作用下,抗性盒與pMD18-T-budA-Ec質(zhì)粒上的目的基因發(fā)生同源重組,獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-budA-Ec-773。

1.2.3 擴(kuò)增不同長(zhǎng)度同源臂的抗性盒 以pMD18-T-budA-Ec-773質(zhì)粒為模板,用表2中的引物budAk100-a和budAk100-s;budAk200-a和budAk200-s;budAk300-a和budAk300-s;budAk400-a和budAk400-s;budAk500-a和budAk500-s進(jìn)行PCR,獲得中間為安普霉素抗性基因兩端帶有不同長(zhǎng)度同源臂的抗性盒。所得PCR產(chǎn)物用Dpn I限制性內(nèi)切酶處理消除質(zhì)粒模板。

1.2.4E.cloacae/pSC-MSC-red的構(gòu)建 將活化好的E.cloacae接種到50 mL的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到OD600=0.5～0.8時(shí),將培養(yǎng)物置于冰上冰浴30 min。冰浴結(jié)束后5000 r/min,4 ℃離心10 min收集細(xì)胞,用預(yù)冷的無(wú)菌水清洗細(xì)胞三次,然后將其懸浮于無(wú)菌水,調(diào)整細(xì)胞終濃度為OD600=30,獲得感受態(tài)細(xì)胞。每100 μL感受態(tài)細(xì)胞中加入1 μg的pSC-MSC-red質(zhì)粒,冰浴靜置10 min后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化[20]。電轉(zhuǎn)儀設(shè)置為2.0 kV,200 Ω及25 μF,將電轉(zhuǎn)杯置于電轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化[7]。電擊轉(zhuǎn)化完成后在感受態(tài)細(xì)胞中加入適量LB培養(yǎng)基,并將其置于37 ℃,200 r/min搖床復(fù)蘇1 h。復(fù)蘇完成后5000 r/min離心3 min收集菌體,將菌體全部涂布于含有卡那霉素抗性(100 μg/mL)的固體LB培養(yǎng)基上,37 ℃過(guò)夜靜置培養(yǎng)。將平板上生長(zhǎng)起來(lái)的陽(yáng)性單克隆命名為E.cloacae/pSC-MSC-red。

1.2.5 缺失E.cloacae的budA基因 制作E.cloacae/pSC-MSC-red的電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600=0.1時(shí),將培養(yǎng)搖床溫度改為42 ℃,以誘導(dǎo)pSC-MSC-red質(zhì)粒上的Red重組酶表達(dá),其余過(guò)程與1.2.4所述相同。將帶有不同長(zhǎng)度同源臂的抗性盒分別電擊轉(zhuǎn)化入E.cloacae/pSC-MSC-red感受態(tài)細(xì)胞中,復(fù)蘇后涂布于帶有安普霉素抗性(50 μg/mL)的固體LB培養(yǎng)基上37 ℃ 過(guò)夜靜置培養(yǎng)。待單克隆生長(zhǎng)起來(lái)后用表2中的引物budAy-a及Test773做菌落PCR驗(yàn)證,budAy-a引物以budA-Ec的下游基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì),Test773引物以安普霉素抗性基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)budA基因被成功敲除后將基因缺失菌命名為E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red,該菌株帶有卡那霉素抗性和安普霉素抗性。

1.2.6 消除E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red菌株的抗性標(biāo)記 消除抗性標(biāo)記需要Flp重組酶和FRT序列的共同作用[2]。由于pSC-MSC-flp質(zhì)粒和pSC-MSC-red質(zhì)粒所用載體均為pSC-MSC,在轉(zhuǎn)化pSC-MSC-flp質(zhì)粒前需消除E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red的pSC-MSC-red質(zhì)粒。方法為將E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red接種于不含抗性的LB液體培養(yǎng)基中,傳代3次后劃線分離得到數(shù)個(gè)單克隆。將每一個(gè)單克隆分別接種到兩種LB培養(yǎng)基中,一種含有100 μg/mL的卡那霉素,另一種不含抗生素。用菌落PCR驗(yàn)證能在無(wú)抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)起來(lái)且在含卡那霉素抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)不起來(lái)的單克隆。

將消除質(zhì)粒的菌株命名為E.cloacaeΔbudA-773,該菌只帶安普霉素抗性,制作該菌的感受態(tài)細(xì)胞,按照1.2.4的方法將pSC-MSC-flp質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入該菌中,獲得菌株E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp。將E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp接種到液體LB培養(yǎng)基中42 ℃?zhèn)鞔?次,與消除質(zhì)粒方法相同篩選出消除了抗性標(biāo)記的E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp,將其命名為E. cloacae ΔbudA/pSC-MSC-flp。

按照消除pSC-MSC-red質(zhì)粒的方法消除掉E.cloacaeΔbudA/pSC-MSC-flp的pSC-MSC-flp質(zhì)粒,得到無(wú)抗性標(biāo)記的budA基因缺失菌,將其命名為E.cloacaeΔbudA,該菌只帶有氨芐霉素抗性。

1.2.7E.cloacaeΔbudA生理特性研究 將E.cloacae及E.cloacaeΔbudA分別接種到50 mL液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)8 h獲得發(fā)酵種子,將該種子接種到總體積為5 L的發(fā)酵罐(內(nèi)含3L培養(yǎng)基)中進(jìn)行批次發(fā)酵。發(fā)酵條件為通風(fēng)量2 L/min,轉(zhuǎn)速300 r/min,溫度37 ℃,用30%的NaOH溶液控制發(fā)酵過(guò)程的pH為6.8。發(fā)酵過(guò)程每3 h取樣檢測(cè)葡萄糖、乙偶姻、琥珀酸、乳酸、乙酸、2,3-丁二醇和乙醇等組分的含量變化。發(fā)酵液組分測(cè)定采用高效液相色譜法,色譜柱為HPX-87H,流動(dòng)相為0.005 mol/L的稀硫酸溶液,流速為0.8 mL/min,柱溫箱為60 ℃,使用視差檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pSC-MSC-red及pSC-MSC-flp質(zhì)粒的構(gòu)建

pSC-MSC-red和pSC-MSC-flp的構(gòu)建按照材料與方法描述進(jìn)行。提取的質(zhì)粒使用引物pSC-s及pSC-a進(jìn)行PCR驗(yàn)證。重組質(zhì)粒pSC-MSC-red的PCR結(jié)果見(jiàn)圖1a,重組質(zhì)粒pSC-MSC-flp的PCR結(jié)果見(jiàn)圖1b。圖1a中,泳道2為實(shí)驗(yàn)組在2500～3000 bp位置處有一目的條帶,red基因原始長(zhǎng)度為1885 bp,PCR產(chǎn)物中包含的質(zhì)粒序列為718bp,其總長(zhǎng)與目的條帶大小相符,證明pSC-MSC-red質(zhì)粒構(gòu)建成功。同理,圖1b中,泳道4為實(shí)驗(yàn)組在1500～2000 bp位置處有一目的條帶,flp基因原始長(zhǎng)度為1272 bp,其PCR產(chǎn)物中質(zhì)粒序列為718 bp,其總長(zhǎng)也與圖中目的條帶相符,證明pSC-MSC-flp質(zhì)粒也構(gòu)建成功。圖1a及圖1b中陰性對(duì)照(泳道1和泳道3)是以pSC-a和pSC-s為引物,以pSC-MSC空質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的目的條帶為特異性擴(kuò)增的陽(yáng)性克隆。兩重組質(zhì)粒上目的基因序列測(cè)定結(jié)果與參考序列完全一致。

圖1 重組質(zhì)粒pSC-MSC-red和pSC-MSC-flp的PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR results of recombinant plasmid pSC-MSC-red and pSC-MSC-flp注:泳道1和泳道3為以空載質(zhì)粒pSC為模板擴(kuò)增得到的條帶,泳道2為以pSC-MSC-red質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到的條帶,泳道4為以pSC-MSC-flp質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到的條帶,Marker為10 kp。

2.2 不同長(zhǎng)度同源臂抗性盒的構(gòu)建

應(yīng)用Red重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除時(shí),不同菌株中所需同源片段長(zhǎng)度不同,大腸桿菌為36 bp,而在其他細(xì)菌中則稍微長(zhǎng)一些。在霍亂弧菌中,50 bp或100 bp的同源臂便足以對(duì)目的基因進(jìn)行敲除,但是其同源臂長(zhǎng)度增加到1000 bp時(shí),重組效率顯著提高[6]。在K.Pneumoniae中200 bp同源臂可獲得重組子,500 bp同源臂重組效率顯著提高[7]。為了研究不同長(zhǎng)度同源臂對(duì)于基因重組效率的影響,本文構(gòu)建了帶有39、100、200、300、400、500 bp同源臂的抗性盒用于E.cloacae的基因敲除。

按照材料與方法描述過(guò)程將帶39 bp同源臂的抗性盒轉(zhuǎn)入到E.coliDH5α/PIJ790/pMD18-T-budA-Ec中,用安普霉素抗性平板進(jìn)行篩選。待菌落生長(zhǎng)出來(lái)后,挑取部分單克隆使用通用引物M13-47和M13-48進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)圖2。未重組時(shí),以質(zhì)粒pMD18-T-budA-Ec為模板擴(kuò)增出來(lái)的條帶大小應(yīng)為1710 bp,圖中泳道7和9對(duì)應(yīng)的單克隆未發(fā)生重組。同源重組發(fā)生后,部分基因被抗性編碼基因替換,擴(kuò)增條帶大小應(yīng)為2410 bp。泳道1、2、3、6、8對(duì)應(yīng)的單克隆成功重組,pMD18-T-budA-Ec-773質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2中,泳道4、5、10含有雙條帶,其原因是pMD18-T載體為高拷貝質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入抗性盒后只有一部分pMD18-T-budA-Ec質(zhì)粒與抗性盒發(fā)生了重組,另外一部分pMD18-T-budA-Ec保持未重組狀態(tài)。為了解上述問(wèn)題,在后期的實(shí)驗(yàn)中可以嘗試通過(guò)Overlap PCR直接擴(kuò)增出帶有不同長(zhǎng)度源臂的抗性盒。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-budA-Ec-773的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR results of recombinant plasmid pMD18-T-budA-Ec-773 注:泳道1～10為帶39 bp抗性盒與E.coli DH5α/PIJ790/pMD18-T-budA-Ec重組后各單克隆菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果,Marker為10 kb。

以pMD18-T-budA-Ec-773質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增出帶有不同長(zhǎng)度同源臂的抗性盒,結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3中泳道1、2、3、4、5分別對(duì)應(yīng)了帶有500、400、300、200、100 bp同源臂的抗性盒;泳道6為以pIJ790質(zhì)粒為模板使用引物FRT-s1和FRT-a1擴(kuò)增得到的帶有39 bp同源臂的抗性盒。

圖3 不同長(zhǎng)度同源臂的抗性盒的PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of different length homologous arms注:泳道1、2、3、4、5、6分別為帶有500、400、300、200、100、39 bp同源臂的抗性盒的。

2.3 不同長(zhǎng)度同源臂抗性盒的重組效率

為了確定E.cloacae中基因重組所需同源臂的最適長(zhǎng)度,分別將帶有39、100、200、300、400、500 bp同源臂的抗性盒轉(zhuǎn)化入E.cloacae/pSC-MSC-red。待單菌落生長(zhǎng)起來(lái)后,計(jì)算各長(zhǎng)度同源臂抗性盒重組的效率。基因重組的效率與所加入的抗性盒DNA的量有關(guān),可以用每1 μg抗性盒DNA轉(zhuǎn)化入宿主菌后抗性平板上生長(zhǎng)起來(lái)的單菌落中陽(yáng)性克隆的個(gè)數(shù)來(lái)表示敲除效率。各長(zhǎng)度同源臂抗性盒重組效率見(jiàn)表3。從表中可以看出,同源臂長(zhǎng)度為39 bp和100 bp時(shí)重組效率為零;同源臂長(zhǎng)度增加到200、300及400 bp時(shí),重組效率分別為6.1、14.3和38.8 CFU/μg;同源臂長(zhǎng)度增加到500 bp時(shí),重組效率有較大提高,為131.5 CFU/μg。基于此結(jié)果,500 bp長(zhǎng)度的同源臂抗性盒更適用于E.cloacae的基因重組。

表3 不同長(zhǎng)度同源臂抗性盒的重組效率Table 3 Recombination ratios of different length homologous extensions

Red重組酶應(yīng)用于E.cloacae的基因最高重組效率為131.5 CFU/μg,略低于大腸桿菌(500 CFU/μg)[7],其原因可能是Red重組酶中的Gam蛋白來(lái)源于E.coli,其對(duì)于E.cloacae的RecBCD核酸外切酶抑制能力較弱。在K.pneumoniae的基因重組中,同樣存在重組效率(266.8 CFU/μg)低于E.coli的情況,通過(guò)抑制宿主菌的RecBCD核酸外切酶活性,可以提高Red重組系統(tǒng)在K.pneumoniae中的敲除效率[22]。

2.4 利用Flp重組酶消除E. cloacae ΔbudA-773/pSC-MSC-red菌株的抗性標(biāo)記

按照1.2.6所述方法消除E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-red的pSC-MSC-red質(zhì)粒。用表2中的引物pSC-a和pSC-s PCR驗(yàn)證能在無(wú)抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)起來(lái)且在帶卡那霉素抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)不起來(lái)的單克隆,結(jié)果見(jiàn)圖4a。圖中泳道2為消除質(zhì)粒前的對(duì)照,在2500 bp左右處有一目的條帶;消除了pSC-MSC-red質(zhì)粒后擴(kuò)增不出條帶(泳道1),說(shuō)明pSC-MSC-red質(zhì)粒已經(jīng)成功消除。

圖4 消除宿主菌外源質(zhì)粒及抗性標(biāo)記的PCR驗(yàn)證Fig.4 PCR results of eliminating the plasmid and resistance marker from E. cloacae ΔbudA-pSC-MSC-flp注:泳道1、3、5為消除菌株質(zhì)?；蚩剐詷?biāo)記基因后的PCR結(jié)果,為實(shí)驗(yàn)組;泳道2、4、6為消除菌株質(zhì)粒或抗性標(biāo)記基因前的PCR結(jié)果,為對(duì)照組。

按照1.2.6所述方法傳代培養(yǎng)E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp,使用表2中的引物budAy-a及Test773 PCR驗(yàn)證能在無(wú)抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)起來(lái)且在帶安普霉素抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)不起來(lái)的單克隆,結(jié)果見(jiàn)圖4b。圖中泳道4為消除抗性標(biāo)記前的對(duì)照,在1500 bp左右處有一目的條帶;消除抗性標(biāo)記后擴(kuò)增不出條帶(泳道3),說(shuō)明E.cloacaeΔbudA-773/pSC-MSC-flp菌株的安普霉素抗性標(biāo)記已成功消除。

按照1.2.6所述方法消除E.cloacaeΔbudA-pSC-MSC-flp的pSC-MSC-flp質(zhì)粒。用表2中的引物pSC-a和pSC-s PCR驗(yàn)證能在無(wú)抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)起來(lái)且在帶卡那霉素抗性培養(yǎng)基上長(zhǎng)不起來(lái)的單克隆,結(jié)果見(jiàn)圖4c,其中6號(hào)泳道為消除質(zhì)粒前的對(duì)照,在1500～2000 bp處有一目的條帶,消除pSC-MSC-flp質(zhì)粒后,擴(kuò)增不出條帶(泳道5),說(shuō)明pSC-MSC-flp質(zhì)粒已經(jīng)成功消除。

2.5 E. cloacae ΔbudA生理特性研究

為了考察敲除E.cloacae的budA基因后其生理特性的變化,將E.cloacae及E.cloacaeΔbudA分別接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行批次發(fā)酵,其結(jié)果見(jiàn)圖5,其中圖5(a)和圖5(b)為E.cloacae的發(fā)酵結(jié)果;圖5(c)和圖5(d)為E.cloacaeΔbudA發(fā)酵結(jié)果。E.cloacae發(fā)酵過(guò)程中合成了一定量的乙偶姻且2,3-丁二醇產(chǎn)量逐漸增加,而E.cloacaeΔbudA整個(gè)發(fā)酵過(guò)程都不再合成乙偶姻和2,3-丁二醇。此外,敲除E.cloacae的budA基因后,菌株的生長(zhǎng)變緩,野生型菌株在9 h左右底物全部耗盡,菌體生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期,OD600為13.79。而突變株發(fā)酵9 h還有16.69 g/L的葡萄糖殘余,OD600只有12.03。細(xì)菌代謝糖類合成乙酸或乳酸等酸類物質(zhì)時(shí),大量有機(jī)酸會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,而醇類物質(zhì)對(duì)菌體的抑制作用要低很多[23]。在E.cloacaeΔbudA中,敲除了乙偶姻的合成基因,2,3-丁二醇的合成被阻斷,細(xì)菌合成較多有機(jī)酸使得生長(zhǎng)變緩。

圖5 E. cloacae及E. cloacae ΔbudA批次發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Batch fermentation of E. cloacae and E. cloacae ΔbudA注:(a)和(b)為E. cloacae發(fā)酵結(jié)果;(c)和(d)為E. cloacae ΔbudA發(fā)酵結(jié)果。

發(fā)酵15 h后發(fā)酵液中各組分具體含量見(jiàn)表4。從表中可以看出,野生型菌株合成了(0.97±0.08) g/L的乙偶姻和(12.25±0.71) g/L的2,3-丁二醇以及其他一些有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物,而E.cloacaeΔbudA的發(fā)酵液中檢測(cè)不到乙偶姻和2,3-丁二醇,主要代謝產(chǎn)物為琥珀酸和乳酸。發(fā)酵結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明E.cloacae的budA基因已被成功缺失。

表4 E. cloacae和E. cloacae ΔbudA發(fā)酵結(jié)果Table 4 Batch fermentation of E. cloacae and E. cloacae ΔbudA

3 結(jié)論

本文以budA基因?yàn)槔?詳細(xì)地?cái)⑹隽薘ed重組系統(tǒng)在E.cloacae基因重組中的應(yīng)用。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSC-MSC-red質(zhì)粒和pSC-MSC-flp質(zhì)粒,在Red重組酶的作用下成功敲除了E.cloacae的budA基因,并通過(guò)Flp重組酶成功消除了突變株的抗性標(biāo)記。運(yùn)用本文的方法對(duì)E.cloacae進(jìn)行基因缺失的周期一般為3個(gè)周。除了budA基因外,運(yùn)用該系統(tǒng)還成功地缺失了E.cloacae的一些其他基因?？偟膩?lái)說(shuō),該系統(tǒng)的建立,有利于快速構(gòu)建E.cloacae的單基因和多基因重組突變株,將促進(jìn)E.cloacae的代謝工程改造和其在多方面的應(yīng)用。